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实验四. 高效液相色谱法测定咖啡因的含量. 实验目的. 1 ．学习高效液相色谱仪的基本结构和基本操作。 2 ．了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3 ．掌握采用高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方 法。. 实验原理.
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实验四 高效液相色谱法测定咖啡因的含量
实验目的 1．学习高效液相色谱仪的基本结构和基本操作。 2．了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3．掌握采用高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方 法。
实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相的色谱法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分析。本实验以咖啡因为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中咖啡因的含量。用反相液相色谱法将咖啡因分离。以咖啡因标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度做工作曲线。再根据样品中咖啡因的峰面积，由工作曲线算出其浓度。
仪器与试剂 1．Agilent 1100高效液相色谱仪；XDB-C8色谱柱（4.6 mm×150 mm）；填料粒径 5μm；25μL平头微量注射器。 2.容量瓶（100mL、10mL）；移液管 3．系列咖啡因标准溶液 准确称取25mg咖啡因标准试剂置于100mL烧杯中，定容至100mL容量瓶中，摇匀。分别吸取1mL、2mL、3mL、4mL标准溶液于10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀。未知浓度咖啡因溶液2组。 4．流动相 20%甲醇 + 80%二次蒸馏水
实验步骤 1．先配制一系列咖啡因标准溶液。 2．打开电脑，开仪器（由上至下）点开Instrument Online调整流动相流量，打开Purge阀，排气泡，然后调小流量，观察基线是否平稳。 3．待基线平稳后，选择参数，设定方法。用待进样溶液清洗过的平头微量注射器，吸取25μL溶液，进样。由小到大测定标准溶液的浓度，以色谱峰面积对其浓度做工作曲线。 4．测定两个未知浓度样品的峰面积，从工作曲线上求出未知浓度样品的浓度。 5．关机。先关仪器（从下至上），再依次关工作站和电脑。 6．数据处理。
