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目的基因的克隆 — PCR 法 扩增目的基因片断

目的基因的克隆 — PCR 法 扩增目的基因片断. PCR(Polymerase Chain Reaction) ，聚合酶链式反应 , 模拟了发生在细胞内的 DNA 复制的过程. DNA 的结构（ 1 ）. 三磷酸核糖核苷 NTP. 三磷酸脱氧核糖核苷 dNTP. 三磷酸双脱氧核糖核苷 ddNTP. DNA 的结构（ 2 ）. A 腺嘌呤 G 鸟嘌呤 C 胞嘧啶 U 尿嘧啶 T 胸腺嘧啶. 五种碱基. A-T C-G. DNA 的结构（ 3 ）. 氢键维持了 DNA 的双螺旋结构. DNA 的复制（ 1 ）.

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目的基因的克隆 — PCR 法 扩增目的基因片断

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Presentation Transcript

  1. 目的基因的克隆— PCR法扩增目的基因片断 PCR(Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应,模拟了发生在细胞内的DNA复制的过程

  2. DNA的结构（1） 三磷酸核糖核苷NTP 三磷酸脱氧核糖核苷dNTP 三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP

  3. DNA的结构（2） A腺嘌呤 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 T胸腺嘧啶 五种碱基 A-T C-G

  4. DNA的结构（3） 氢键维持了DNA的双螺旋结构

  5. DNA的复制（1） 3’-OH进攻5’- Pi DNA聚合酶催化 DNA的延伸方向:5‘->3’

  6. DNA的复制（2） DNA复制相关蛋白 在复制起始点打开 双链DNA 然后DNA解链酶 结合到单链DNA上 进一步解开双链DNA

  7. DNA的复制（3）

  8. DNA的复制 和 体外的模拟 模板（母链） 细胞内源 外源加入 打开双链 解链酶 加热变性 维持单链 单链结合蛋白 高温 引物 引物合成酶 外源加入 底物dNTP 细胞内源 外源加入 聚合酶 细胞内源 外源加入 反应环境 细胞内环境 缓冲液

  9. PCR循环--变性

  10. PCR循环--变性

  11. PCR循环--变性

  12. PCR循环—退火

  13. PCR循环—延伸

  14. PCR循环—延伸

  15. PCR循环—延伸

  16. PCR循环—延伸

  17. PCR整个过程

  18. 讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度 • 为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板 • 防止非特异性的引物退火 • 延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 • DNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶 常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 0C条件下，能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 0C左右。

  19. 讨论2：影响PCR质量的一些因素 • 模板:选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。 • 目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。 • 引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断 。 • 酶：纯度、可信度，碱基错配率<1/10000。

  20. 讨论3：PCR的应用 清除人体内细胞中自由基 抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌 高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰 食品、保健品、药品、化妆品 • 从蓝藻里面克隆SOD (超氧化物歧化酶) 基因库检索SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白

  21. 讨论3：PCR的应用 炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球 生命力强、传染快、发作快、死亡率高。 • 检测粉末样品是否含 有炭疽杆菌 有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。 用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCR

  22. 讨论3：PCR的应用 基因组计划首要任务就是测序 Sanger双脱氧法 • 基因测序 ddATP-绿色荧光 ddTTP-红色荧光 ddCTP-蓝色荧光 ddGTP-橙色荧光

  23. 讨论3：PCR的应用 • 基因测序

  24. 实验步骤： 无菌去离子水 34ul 10X PCR缓冲液 5ul dNTP混合液 4ul Mg++溶液 3ul 引物1 1ul 引物2 1ul 模板基因组DNA 1ul rTag聚合酶 1ul 1.取一个干净PCR专用小管 2.往PCR管里面加入各种试剂 3.设定好机器各种参数 4.开始PCR 5.电泳检测PCR结果

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