流式细胞术原理和应用

1. 流式细胞术原理和应用 • 游东生 • Beckman Coulter公司上海代表处 • 13636440348 • dsyou@beckman.com

2. CYTOME: 细胞组，包括细胞结构、亚细胞结构和细胞功能元件 • CYTOMICS: 细胞组学，研究异质性细胞组的科学，特别是以生物信息学方法研究单细胞分子水平由基因、蛋白和环境引起的细胞异质性 • PROTEOME: 蛋白组，指单个单位生命组分（细胞器、细胞、组织、器官乃至生命个体等）所有蛋白构成 • PROTEOMICS: 蛋白组学，研究异质性生命组分蛋白组的科学，特别是由基因和环境引起的变化。

3. 系统生物学 干扰RNA（RNAi） 信号传导蛋白（Cell Signalling）

4. 环境－细胞组－基因/蛋白组 相互作用网络

5. Uncertain 6% Biochemical Cell-based 23% 40% Biochemical Cell-based 60% 71% Growth in cell based assays------以细胞为目标 Past 5 years In Development Source: Dr. Priya Kunapuli, Senior Research Scientist, Merck Research Laboratories; Dec. 2002 • Key takeaways: • Rapid movement to cell-based assays for contextual analysis

6. 细胞组学研究的过去、现在和未来 分光高度计，荧光高度计，干涉光高度计 18世纪，明视野显微镜发明 放射自显影 暗视野光镜，相差显微镜，微分干涉对比显微镜，偏振光显微镜，荧光显微镜 细胞计数仪 细胞成像定量分析系统 流式细胞仪 单光子共聚焦显微镜，多光子共聚焦显微镜 目标细胞分选 ??? 大体荧光成像系统

7. 形态学研究工具的发展历程 High-end automated HCS systems Confocal scanning system Research grade fluorescence scope Basic clinical scope Simple optical microscope

8. 细胞定量工具发展历程 Cell Lab Quanta 6 color plus cytometer / sorter – high-end res. 5-6 color cytometer – clinical / high-end res. 2-4 color cytometer – simple assays Automated Cell viability Simple cell counters & sizers

9. CONFOCAL －SUB-CELL OR STRUCTURE ORIENTED IMAGING

10. 流式细胞术 （FLOW CYTOMETRY） 　 利用流式细胞仪( flow cytometer )通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并 通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。 & 检测表面标记物 & 检测胞浆标记物 & 检测胞核内标记物 & 检测可溶性蛋白

11. 流式细胞术应用基础知识 1)认识荧光素 2)抗原抗体结合的基础和特点 3)对待测目标细胞标记物的理解－应用的背景知识

12. 五光十色的荧光素 • 单分子荧光素 • 耦合的复合荧光素分子 • 新型的荧光素样荧光物质—Qdots

13. Qdots-纳米晶体：未来的荧光素 同一种光源激发一种晶体发射多种荧光 Qdots 605的激发波长和发射波长（VERY SHARP）

14. 用荧光标记抗体 抗体特异性地结合细胞上对应的抗原 表达该抗原的细胞被标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧光强度强 阳性细胞百分比或浓度 靶蛋白浓度

15. 从模拟信号到先进的数字化信号 • 数字化信号转换 • 对数查表保证最优化的线性和稳定性 • 4次幂转换误差< 1% • 光纤通讯 • 速度快 • 保真性高 • 实时获取数据和分析报告结果 • 20比特的数据，补偿数字化 • 全矩阵正反补偿 • 离线补偿 线性对对数查表 VS 普通对数放大

16. 让目标细胞特异性带上荧光！！！ 1)抗原抗体结合 2)荧光素特异性结合 &细胞器 &生物大分子 3)生物大分子之间的结合，如 PS 与ANNEXIN V的结合

18. IgG1, IgG2 and IgG4 IgG3 抗原抗体结合非特异性因素 • 抗体的交叉反应－所以最好选用单克隆抗体 • FC受体与Fc段的结合 • 其它因素 例如： IgG-CH3与单核细胞上FcR结合； IgE-CH4与肥大细胞上FcR结合

19. 从模拟信号到先进的数字化信号 • 数字化信号转换 • 对数查表保证最优化的线性和稳定性 • 4次幂转换误差< 1% • 光纤通讯 • 速度快 • 保真性高 • 实时获取数据和分析报告结果 • 20比特的数据，补偿数字化 • 全矩阵正反补偿 • 离线补偿 线性对对数查表 VS 普通对数放大

20. 抗原抗体结合的特异性

21. 血液系统各系列细胞分化阶段抗原表达

22. 原T细胞 CD3-αβ- CD4-/CD8- CD3+/γδ+ CD4-/CD8- CD3+/αβ+ CD4+/CD8+ 8+ 4+ 4+ 8+ 抗己 抗己 8+ 4+ T细胞分化发育与膜表面分子的表达： 胚胎肝脏、骨髓 浅皮质区 胸 腺 阳性 选择 4-8- 深皮质区 MHCII MHCI 4-8- 阴性 选择 髓 质 区 CD4-CD8- CD4+ CD8- CD4-CD8+

23. CD抗原及其相关细胞群 • 细胞群 CD抗原 • T细胞 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7 CD8 CD28 CD38 • B细胞 CD10 CD19 CD20-CD24 CD37 CD72-CD75 • 髓系细胞 CD13 CD14 CD15-CD17 CD33 CD34 CD35 • NK细胞 CD16 CD56 CD57 CD94 • 血小板 CD31 CD41 CD42a CD42b CD61 CD62p CD63 • 激活抗原 CD26 CD30 CD69 CD95-CD97 • 粘附分子 CD11a-c CD18 CD29 CD44 CD49a-f • 内皮细胞 CD105 CD106 CD109 • 细胞因子受体 CD25 CD115 CD117 CD122 CD126

24. 流式细胞仪的主要特点 • 高速测定细胞，大样本计数 • 检测稀有细胞 • 多参数分析 • 自动化 • 细胞分选

25. 流式细胞仪工作原理

26. 基本原理 流路 • 流动室 • 鞘液SHEATH • 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml 光路 • 光源 • 滤片 • 光电倍增管PMT HV 电路 • 放大电路HV及GAIN 增益 • A/D转换 统计 • 计算机

27. 流路 • 单细胞悬液 • 大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细胞悬液 注射进入鞘液中 • 这一过程,成为流体动力学聚焦

28. Injector Tip Sheath fluid Fluorescence signals Focused laser beam 流动室

29. 675BP FL4 (PC5) 620BPFL3 (ECD) 575BP FL2 (PE) 525BP FL1 (FITC) Air-cooled Argon Ion Laser Side Scatter Detector 645DL 600DL 550DL 488BK Beam Shaping Lenses 488DL Forward Scatter Detector High Sensitivity Quartz Flow Cell 流式细胞仪光路图

30. 单激光激发四色 ------单激光激发四色荧光标准模式 确保在同一个细胞上获得最多的信息

31. 光路 - 滤片特性 • 长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 • 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 • 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过 • 当以 45o角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光，这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter) 630 nm BandPass Filter White Light Source

32. 散射光信号 —— 细胞大小及颗粒性 FS SS

33. 信号 • 散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 • 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 FL5 - PC7

34. 荧光信号 原理： 细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。 通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。

35. 电压调节－利用同型对照：设置背景 • 电压 volts • 增益 Gain 设定阴性和阳性信号强度的临界点

36. FITC 520BP 520 B PE 575BP 荧光补偿 Need to do when we measure signals from more than 1 fluorescence.

37. 4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5

38. 荧光交叉对光路的影响 荧光检测通道1 荧光检测通道2 荧光检测通道3 荧光检测通道4 荧光检测通道5

39. PE+ cells To do colour compensation: For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signal For Pure PE+ cells, = FITC signal - % PE signal PE FITC + cells FITC After compensation PE+ cells PE+ cells GOOD compensation: Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cells X-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cells OVER compensation PE PE FITC + cells FITC + cells FITC FITC 补偿

40. Beckmancoulter -应用最精确的全矩阵软件 利用软件进行全矩阵颜色补偿（任何两个荧光检测通道之间都可以进行补偿）

41. 检测的一般步骤 • 设置检测方案（PROTOCOL) • 染色标本（同型对照，补偿管，检测抗体） • 同型对照管调电压 • 电压不变，补偿管调补偿 • 电压不变，补偿不变，上检测管检测后直接阅读结果

42. 如何看图

44. 流式细胞分选

45. 流式细胞仪分选 • 电荷式分选是当前的主流分选模式 • 高速分选是保证结果的基本条件 • 高纯度和高活性是分选的基本要求 • 可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外） • 提供多种分选流动室 • 光路稳定，紫外激光功率大 • 流式分选和磁珠分选的差别和联系 • BECKMAN COULTER提供工业标准的大型分选机型－Epics ALTRA:能满足绝大多数的分选需求 • BD的FACSVantage：只提供水冷激光和JIA流动室，光路不稳定，不方便检测，分选成本高 • BD的FACSAria：是一种过渡机型，只能提供空冷激光和石英流动室，不适用于大功率分选和活细胞分选 • Cytomation的Moflow是最经典的流式分选机，仅供应少量实验室，操作和人为干涉复杂，在中国无维修和售后服务，价格昂贵

46. + 电荷式流式细胞仪分选系统 FALS Sensor 488 nm laser Fluorescence detector - Charged Plates Single cells sorted into test tubes

47. 流式细胞仪应用

48. CELLS OF THE IMMUNE RESPONSE • INNATE • PMN NUETROPHILS • EOSINOPHILS • BASOPHILS • MONOCYTES / MACROPHAGES • DENDRITIC CELLS: mDC - pDC • NK CELLS • NKT CELLS • gd T LYMPHOCYTES • CD5+ B CELLS • ADAPTIVE • B CELLS • HELPER T-CELLS • Th1 • Th2 • REGULATORY T-CELLS • (Th3) • CYTOTOXIC T-CELLS

49. 细胞免疫功能测定 • 淋巴细胞亚群 • 活化的T淋巴细胞 • 抗原特异性免疫细胞 • 调控性T细胞 • 树突状细胞 • 先天免疫细胞

50. 淋巴细胞亚群