实验技能（一）

1. 实验技能（一） 纯化、薄层色谱

2. 第一部分 实验技能 • 这部分针对保诺的实际情况介绍一些实用的实验技能，主要包括产品纯化、薄层色谱、柱层析、无水无氧操作、催化氢化和色谱分析六个部分。这部分内容是做Reference Standard项目的基础，应认真掌握。

3. §1-1 产品纯化 • 当有机合成反应完成后，如何将产物从反应体系中分离出来就成了最重要的事情了，也就是说需要进行产品纯化，产品纯化是有机合成工作中非常重要的一环。

4. 一、 柱色谱 • 柱色谱的分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。 • 它可用于小量（和微量）的物质的分离、纯化处理。

5. 二、 重结晶 • 重结晶的原理是利用混合物中各组分在某种溶剂中的溶解度不同，而使它们互相分离。 • 它可用于固体物质（一般1克以上）的分离、纯化处理。

6. 1.重结晶提纯法的一般过程为 • 选择适宜的溶剂； • 将粗产品溶于适宜的热的溶液中制成饱和溶液； • 乘热过滤除去不溶性杂质。如溶液的颜色深，则应先脱色，后过滤； • 冷却溶液，使之慢慢析出结晶而杂质则留在母液中，或者杂质析出，而欲提纯的化合物则留在溶液中； • 抽气过滤分离母液，分出结晶体或杂质； • 洗涤结晶，除去附着的母液； • 干燥结晶。

7. 2. 溶剂的选择 • 与被提纯的有机物不起化学反应，对被提纯的有机物应在热溶液中易溶，而在冷溶液中几乎不溶，如果杂质在热溶液中不溶的，宜乘热过滤去杂质，溶剂的沸点，不宜太低，也不宜过高。太低，溶解度改变不大；过高，附于晶体表面的溶剂不易除去。 • 常用的溶剂有苯、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、乙醇等。 • 混合溶剂也经常被采用，如乙醇与水，乙醇与乙醚，乙醇与丙酮，石油醚与乙醚，苯与石油醚等。 • 溶剂的用量一般是溶质用量的10-30倍量。

8. 3.晶体的析出过滤得到的滤液冷却后，晶体就会析出。用冷水或冰水迅速冷却并剧烈搅动溶液时，可得到颗粒很小的晶体，将热溶液在室温条件下静置使之缓缓冷却，则可得到均匀而较大的品体。    如果溶液冷却后晶体仍不析出，可用玻璃抹摩控液面下的容器壁，也可加入品种，或进一步降低溶液温度(用冰水或其它冷冻溶液冷却)。    如果溶液冷却后不析出晶体而得到油状物时，可重新加热，至形成澄清的热溶液后，任其自行冷却，并不断用玻璃棒搅拌溶液，摩擦器壁或投人品种，以加速品体的析出。若仍有油状物开始忻出，应立即剧烈搅拌使油滴分散。3.晶体的析出过滤得到的滤液冷却后，晶体就会析出。用冷水或冰水迅速冷却并剧烈搅动溶液时，可得到颗粒很小的晶体，将热溶液在室温条件下静置使之缓缓冷却，则可得到均匀而较大的品体。    如果溶液冷却后晶体仍不析出，可用玻璃抹摩控液面下的容器壁，也可加入品种，或进一步降低溶液温度(用冰水或其它冷冻溶液冷却)。    如果溶液冷却后不析出晶体而得到油状物时，可重新加热，至形成澄清的热溶液后，任其自行冷却，并不断用玻璃棒搅拌溶液，摩擦器壁或投人品种，以加速品体的析出。若仍有油状物开始忻出，应立即剧烈搅拌使油滴分散。

9. 三、蒸馏 首先了解一些常用有机溶剂的沸点数据：二氯甲烷、丙酮、甲醇、苯、乙酸乙酯、乙醇、甲苯等

10. 1.蒸馏 • 就是将液态物质加热到沸腾变为蒸气，又将蒸气冷凝为液体这个过程的联合操作。它可以分离液体混合物。 • 2.减压蒸馏 • 可分离或提纯沸点教高或性质比较不稳定的液态有机化合物。

13. 四、萃取 • 萃取也是分离和提纯有机化合物常用的操作之一。 • 萃取的原理：设溶液由有机化合物X溶解于溶剂A而成，现如要从其中萃取X，可选择一种对X溶解度极好，而与溶剂A不相混溶和不起化学反应的溶剂B。 • 仪器的选择 • 液体萃取最通常的仪器是分液漏斗，一般选择容积较被萃取液大1-2倍的分液漏斗．

14. 萃取溶剂的选择 • 根据被萃取化合物的溶解度而定，同时要易于和溶质分开，所以最好用低沸点溶剂。一般难溶于水的物质用石油醚等萃取；较易溶者，用乙醚萃取；易溶于水的物质用乙酸乙酯等萃取。每次使用萃取溶剂的体积一般是被萃取液体的1/5～1/3，两者的总体积不应超过分液漏斗总体积的2/3。 • 乳化现象解决的方法 • 较长时间静置； • 若因碱性而产生乳化，可加入少量酸破坏或采用过滤方法除去若由于两种溶剂（水与有机溶剂）能部分互溶而发生乳化，可加入少量电解质（如氯化钠等），利用盐析作用加以破坏。另外，加入食盐，可增加水相的比重，有利于两相比重相差很小时的分离；

15. §1-2 薄层色谱 • 薄层色谱（TLC）是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。最典型的在玻璃板上均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄层板，用毛细管将样品溶液点在起点处，把此薄层板置于盛有溶剂的容器中，等溶液到达前沿后取出，晾干，喷以显色剂，测定色斑的位置。

17. 一、吸附剂 • 一般常用的是：硅胶H/GF254 （含荧光物质） ，这是一种含荧光物质的层析用硅胶，可在254 nm的紫外光下观察荧光。

18. 二、点样 • 在距薄层板（2x5cm, 自制）下端5 mm处，划一条线，作为起点线。用毛细管(內径0.3 mm) 吸取样品溶液（一般以乙酸乙酯、二氯甲烷等作溶剂，配成0.1%溶液），垂直地轻轻接触到薄层的起点线上。

19. 三、展开剂的选择 • 极性小的及中等的一般采用石油醚和乙酸乙酯作展开剂，通过调整其配比，使Rf值调到0.3-0.6为佳。 • 极性大的一般采用二氯甲烷和甲醇作展开剂，通过调整其配比，使Rf值调到0.3-0.6为佳。 • 如上述系统不适合可尝试使用石油醚和丙酮、三氯甲烷和甲醇等展开体系。 • 酸或碱性物质由于在薄层板拖尾严重，所以分别在展开体系中加入0.1%乙酸或氨水。 • 如反应物与生成物Rf值接近，可点交叉点加以区别。

20. 化合物的吸附能力（亲和力）: • 化合物的吸附能力（亲和力）与分子极性有关。分子极性越强，其吸附能力也就越大。分子中所含极性较大的基团，其吸附能力也较强。通常吸附能力按下列排列次序递增： • -Cl,-Br,-I<C=C<-OCH3<CO2R<C=O<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-CO2H • 色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力（按次序递增）： • 己烷、石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。

21. 四、显色剂 • 紫外灯：多环芳烃基团等 • 碘蒸气：很多有机物显黄棕色 • 茚三酮、浓硫酸等特殊显色剂

22. 柱层析

23. 柱层析 • 概述 • 层析柱的选择 • 吸附剂 • 洗脱剂 • 装柱 • 上样 • 洗脱分离 • 快速柱层析 • 反相硅胶板和反相硅胶柱

24. 一、概述 柱层析，又叫柱色谱(Column Chromatography)，通常在玻璃管中填入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固定吸附剂（如硅胶和氧化铝）。当待分离的混合物从柱顶加入，流经吸附剂（固定相）时就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱剂（流动相）。当洗脱剂流经吸附剂时，便发生了吸附和解吸过程，即混合物的各组分在固定相和流动相之间发生无数次的交换。由于各组分对吸附剂的吸附能力（或称亲和力）不同，便以不同的速度随流动相下移，形成若干色带。吸附能力最弱的组分随洗脱剂首先流出。分别收集各组分，进行逐个鉴定，从而达到分离纯化的目的。 作为一种十分高效的分离提纯方法，柱色谱有着相当广的应用范围，适用于大量、少量甚至微量物质的分离。 关键词：吸附和解吸、吸附能力、物理过程。

26. 二、层析柱 .任何细颈玻璃管或带旋塞的滴定管均可用作层析柱。 . 专门定制各种尺寸规格的带有特氟珑旋塞和底部配备砂芯（以代替玻璃棉）的层析柱。 . 层析柱的选择。 Column Size (ml) Fraction Size (ml) Sample Size (g) 200 10 1~2 400 20 3~5 600 30 5~8 1000 50 10 2000 100 20~30 4000 150~200 50 8000 250~400 100

28. 三、吸附剂 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝等，颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜。颗粒太大，洗脱时溶剂推进太快，分离效果不好，反之如果颗粒太小，展开慢而造成拖尾不集中，分离效果也不好。 1、硅胶 硅胶一般分为硅胶G(掺入13%的粘合剂煅石膏)、硅胶H（不含粘合剂，层析用）和硅胶H/GF254（含荧光物质）。柱层析一般用比表面积300-400 米2/克，颗粒度在300目以下的硅胶H做吸附剂。 2、氧化铝 色谱用氧化铝一般可分为酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝是用1%盐酸浸泡后用蒸馏水洗至悬浮液PH=4~4.5，用于分离酸性物质。中性氧化铝PH=7.5,用于分离中性物质，其应用最广。碱性氧化铝PH=9~10，一般用于分离生物碱等化合物。

29. 3、吸附剂的选择 选择吸附剂的首要条件是与被吸附物无化学作用。 氧化铝的极性比硅胶大，比较适合用于分离极性较小的化合物如烃、醚、醛、酮、卤代烃等。因为极性化合物被氧化铝较强烈地吸附，分离较差。相反，硅胶适合用于分离极性较大的化合物如羧酸、醇、胺等，而非极性化合物在硅胶上吸附较弱，分离较差。 4、吸附剂的活性 吸附剂的活性与其含水量有关。含水量越低，活性越高。将氧化铝放在高温炉（350℃-400℃）烘3小时得无水氧化铝，加入不同量水分得不同程度活性氧化铝。一般常用Ⅱ-Ⅲ级（硅胶也可如法处理）。 Activity Alumina(% water) Silica gel(% water) Ⅰ 0 0 Ⅱ 3 5 Ⅲ 6 15 Ⅳ 10 25 Ⅴ 15 38

30. 5、化合物的吸附能力（亲和力） 化合物的吸附能力（亲和力）与分子极性有关。分子极性越强，其吸附能力也就越大。分子中所含极性较大的基团，其吸附能力也较强。通常吸附能力按下列排列次序递增： -Cl,-Br,-I<C=C<-OCH3<CO2R<C=O<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-CO2H 6、吸附剂的用量 通常情况下，待分离样品量和吸附剂的加入量比例为1:30~60 (硅胶)、1:20~50（氧化铝）。当然根据分离的具体情况可作适当调整；吸附剂填入层析柱的长度和层析柱的宽度（直径）的比例一般为10~20:1,最好不少于7：1，当然这一比例关系也可随具体的分离效果作适当调整。 层析柱、吸附剂和待分离样品的经验选择关系 样品量(g) 吸附剂用量(g) 柱的直径(mm) 柱高(mm) 0.01 0.3 3.5 30 0.1 3.0 7.5 60 1 30 16 130 10 300 35 280 *注：具体选择应视样品的分离情况而定。

31. 四、洗脱剂 选择洗脱溶剂时应考虑到被分离各物质的极性和溶解度。 非极性化合物用非极性溶剂，而极性溶剂对于洗脱极性化合物是有效的。被分离各物质应在洗脱溶剂中有非常好的溶解性，否则会严重影响分离效果。若欲分离的混合物组成复杂，单一溶剂往往不能达到有效的分离，通常可以选用混合溶剂作洗脱剂。 下列为柱色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力（按次序递增）： 己烷、石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。 实验室一般常用石油醚(正己烷)/ 乙酸乙酯系(分离极性较小的化合物)和二氯甲烷(氯仿)/甲醇系(分离极性较大的化合物)。对于分离极性较大的化合物，如氨类、酰胺类化合物，为防止其产生拖尾现象，可在洗脱剂中加入少量的三乙氨、氨水或醋酸。 *具体选择应参照TLC的结果选择合适的洗脱剂。

32. 五、装柱 *重要事项：装柱一定要在抽风良好的通风橱中进行，并带好口罩，以防吸入过多的硅胶或氧化铝粉尘而对身体产生致命伤害。 装柱是柱层析中最为关键的操作，装柱的好坏将直接影响分离效率。 首先必须将层析柱垂直固定在铁架上，填充时要求将柱填装均匀、严实，不应夹有空气泡，并使柱顶表面保持水平。 柱层析的装柱一般有干法和湿法二种。下面以吸附剂硅胶为例分别讲述这两种装法。

33. 1、干法装柱：将硅胶慢慢地从柱顶小心加入，同时用橡皮棒轻轻敲击玻璃柱，以使硅胶颗粒尽可能填充均匀严实（可以用水泵抽）。任何隙缝、断层、气泡都将影响分离效果。装好硅胶后，最好在其上铺上一层石英沙，以防止在加入洗脱剂和待分离样品时冲坏硅胶层的顶部。然后从柱顶小心加入非（小）极性溶剂或洗脱剂并使其充分润湿硅胶层，并以一定的流速流入接受瓶。在此过程中，也要防止隙缝、断层、气泡的产生以影响分离效果。通常可以先用非（小）极性溶剂或洗脱剂预洗（可以加压）柱子一定体积消除上述现象后再上样分离，这样也可以把硅胶、石英沙、砂芯（玻璃棉）本身可能带有的一些杂质洗去。1、干法装柱：将硅胶慢慢地从柱顶小心加入，同时用橡皮棒轻轻敲击玻璃柱，以使硅胶颗粒尽可能填充均匀严实（可以用水泵抽）。任何隙缝、断层、气泡都将影响分离效果。装好硅胶后，最好在其上铺上一层石英沙，以防止在加入洗脱剂和待分离样品时冲坏硅胶层的顶部。然后从柱顶小心加入非（小）极性溶剂或洗脱剂并使其充分润湿硅胶层，并以一定的流速流入接受瓶。在此过程中，也要防止隙缝、断层、气泡的产生以影响分离效果。通常可以先用非（小）极性溶剂或洗脱剂预洗（可以加压）柱子一定体积消除上述现象后再上样分离，这样也可以把硅胶、石英沙、砂芯（玻璃棉）本身可能带有的一些杂质洗去。 干法装柱还可以先在层析柱中装入非（小）极性溶剂或洗脱剂，在慢慢加入硅胶。 2、湿法装柱：先把硅胶和非（小）极性溶剂或洗脱剂（一般按体积比1：2）充分混合，形成均一的可流动浆状物，小心倾入层析柱，然后一些石英沙，用一定体积的非（小）极性溶剂或洗脱剂预洗以去除可能产生的气泡。其他注意事项和干法装柱一样。

34. 柱色谱装置 注意：在加待分离样品前，不能让柱子流干。加样时，当非（小）极性溶剂或洗脱剂的液面与硅胶层顶部，即石英沙层相平时（切记不可超过该水平线！否则会产生新的裂缝和气泡！）即可加入样品。 正常展开的层析和应避免的的两种情况的对比 左为水平表面，中为非水平表面右为夹有空气泡的情形

36. 六、上样 上样一般按待分离物的性质而分为液体上样和固体上样两种。 1．液体上样：把要分离的试样配制成适当浓度的溶液。将硅胶上多余的溶剂放出，直到柱内液体表面到达石英砂表面时，停止放出溶剂。沿管壁加入试样溶液，注意不要使溶液把石英砂、硅胶层冲松浮起，试祥溶液加完后，开启下端旋塞，使液体渐渐放出，至溶剂液面和石英砂层表面相齐(勿使石英砂表面干燥)即可用溶剂洗脱。 2、固体上样：当待分离样品为固体时不能直接上样，一般采用拌硅胶上样法。将固体样品溶于丙酮、氯仿等低沸点溶剂中（注意：样品在选择的溶剂中应有相当好的溶解性，尽量避免用甲醇、乙醇等沸点较高的溶剂，以防最后不能除尽而影响分离效果）加入一定量的粗硅胶（一般用100-200目的硅胶，用量大致和样品的重量量比为3-5：1）充分摇匀，然后旋干溶剂，干燥得到的细粉状固体后小心倒入准备好的层析柱中，并使其表面呈水平，再加入一层石英砂以防加入洗脱剂破坏其表面。小心加入洗脱剂后便可开始走样了。当然，如果该固体在洗脱剂中有较好的溶解度，也可使其直接溶于尽量少的洗脱剂中按液体上样法处理。此法只适用于较少的样品量。

37. 七、洗脱和分离 在洗脱和分离的过程中，应当注意以下几点： 1、继续不断地加入洗脱剂，应保持一定高度的液面，在整个操作中勿使硅胶层表面的溶液流干，一旦流干，再加溶剂，易使硅胶柱产生气泡和裂缝，影响分离效果。 2、收集洗脱液，如试样各组分有颜色，在硅胶柱上可直接观察。洗脱后分别收集各个组分。在多数情况下，化合物没有颜色，收集洗脱液时，多采用等份收集，每份洗脱剂的体积随所用硅胶的量及试样的分离情况而定。一般若用50 g硅胶，每份洗脱液的体积常为50 mL。如洗脱液极性较大或试样的各组分结构相近似时，每份收集量要小。 3、控制洗脱液的流出速度，一般不宜太快，太快了柱中交换来不及达到平衡，因而影响分离效果。 4、由于硅胶表面活性较大且显弱酸性，有时可能促使某些成分破坏，所以应尽量在一定时间内完成一个柱色谱的分离，以免试样在柱上停留的时间过长，发生变化或扩散而影响分离效果

39. 八、快速柱层析 柱层析分离的最大的缺点就是耗时，需要极大的耐心。如果要在分离效果和时间两者间取一个比较高的“性价比”的话，那么快速柱层析（Flash Column Chromatography）无疑就是最好的选择。 和普通柱层析相比，不同之处在于快速柱层析是用大约10 psi的压力迫使流动相以较快的速度通过固定相。快速柱层析特别适用于样品量在0.1-10g，需要组分的Rf值为0.35并与杂质有0.15的Rf差距（TLC）。

40. Select a column that is 10, 20, 40 mm ID based upon preparative requirements. The following table presents a general information on this aspect. Column Diameter Volume of Eluent Sample Load(mg) Fraction Size cm ml Rf>0.2 Rf>0.1 ml 1 100 100 40 5 2 200 400 160 10 3 400 900 360 20 4 600 1600 600 30 5 1000 2500 1000 50 The height of the column normally ranges 15~25cm depending on the resolution. Operation Dry pack adsorbent(silica gel) into the appropriate column. Gently tap vertically to pack the gel. Clamp and assemble. Fill with solvent, pressure slightly to compress the silica gel and force solvent and air through the column. The top of the column should not be allowed

41. to run dry. Apply the samples as a 20 - 25% solution and elute at a flow rate of 5cm/min. Generally, it takes about 5~10 minutes to run the column. Gram quantities are expected to acquired, typically 0.5 - 2.0g. Can be increased to 10g if less resolution is required and/or larger columns are used. Summary Flash Chromatography is a fast, cost efficient Prep LC approach. Separations are based upon traditionally obtained TLC results which are simply extrapolated to prep scale. Best of all, elaborate equipment and the purchase of expensive equipment is not necessary.

42. 九、反相硅胶板和硅胶柱 当被分离的样品为极性很大的化合物（如氨，酸等），用普通的以硅胶为填充料的柱子可能很难有效分离，这时就可以选择反相硅胶板和硅胶柱。其主要的区别在于吸附剂的不同，主要以硅胶作基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料，（其他还可键合C8、C4、C2、苯等）。洗脱剂一般用甲醇（乙睛）和水的混合物。

43. Chromatography • Pre-TLC • Column Chromatograghy

44. 特点 • 分离时间短，效率高 • 操作简便 • 分离样品少

45. 原理 • 各组分对吸附剂吸附能力不同 • 吸附能力弱（即极性较弱的）随流动相移动快 • 吸附能力强（即极性较强的）随流动相移动慢

46. PTLC过程 • 展开缸 • PTLC 板 • 点板 • 展板 • 显色 • 刮板与洗脱

47. 展开缸 • 24 24 7cm • 使用混合溶剂时, 可能会发生边缘效应 • 预防措施: 在四壁放上滤纸有助于蒸气饱和，防止边缘效应 • 流动相液面高度一般为 10--15mm. • 使用混合溶剂体系，应在每次爬板后清洁展缸 • 每次只准备一天的溶剂 • 在爬板时保持展缸密闭

48. PTLC 板 • 吸附剂 • 最常用的吸附剂是硅胶 • 硅胶是无定型多孔物质，略具酸性 • 适用于中性或酸性物质的分离。 • 制备和活化 • 负载量 • 1.0mm， <5mg/cm2 • e.g. 20 ×20cm, 10~100mg

49. 点样--A key step • 工具 • 自动 TLC 取样器 • 自制的玻璃滴管 • 溶剂 • 推荐挥发性溶剂—乙酸乙酯,己烷, 二氯甲烷 • 避免使用不挥发溶剂– 甲醇, 水. 引起问题: 扩散 • 样品的浓度 • PTLC---5~10%