第二章 发酵工业菌种 与种子的扩大培养

1. 第二章 发酵工业菌种与种子的扩大培养

2. 第一节 发酵工业菌种概述 菌种在发酵工业中起着重要作用，它是决定发酵产品是否具有产业化价值和商业化价值的关键因素、是发酵工业的灵魂。

3. 一、发酵工业用菌种的特点及要求 • 能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高 效地合成产物 • 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强 • 遗传性能要相对稳定 • 不易感染它种微生物或噬菌体 • 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） • 生产特性要符合工艺要求

4. 二、已工业化产品生产菌的介绍 1. 抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下： 放线菌（链霉素四环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等） 一些产芽孢的细菌 植物或动物来源

5. 二、已工业化产品生产菌的介绍 2. 氨基酸生产有关的微生物 50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点： 代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。

6. 二、已工业化产品生产菌的介绍 2. 氨基酸生产有关的微生物 AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成调节机制

7. 二、已工业化产品生产菌的介绍 2. 氨基酸生产有关的微生物 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单 氨基酸生产菌的要求： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌 谷氨酸发酵的菌种： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 其它氨基酸生产菌：

8. 二、已工业化产品生产菌的介绍 3. 食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和地衣牙孢杆菌

9. 二、已工业化产品生产菌的介绍 4. 常用的基因表达系统 （1）原核生物 大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌 • 生长迅速、蛋白产量高; • 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； • 外源基因的导入相对容易； • 已建立了整套表达理论及技术.

10. 二、已工业化产品生产菌的介绍 4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统 • 酵母(既是微生物又是真核细胞) • 生长迅速，营养要求不高，易培养； • 安全性好； • 比哺乳动物细胞操作简单； • 具有一定的修饰蛋白的能力。

11. 二、已工业化产品生产菌的介绍 4. 常用的基因表达系统 （2）真核细胞表达系统 • 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统 • 具有准确的转录后修饰功能； • 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； • 具有重组基因的高效扩增和表达能力； • 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； • CHO很少分泌自身的内源蛋白。

12. 二、已工业化产品生产菌的介绍 问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？ 微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。 例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。

13. 第二节 发酵工业菌种的选育 • 工业菌种的分离：菌株分离是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选。进而得到所需微生物的过程。 • 工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

14. 一、菌种的来源 • 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； • 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

15. 二、新种分离与筛选的步骤 • 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 • 采样：有针对性地采集样品。 • 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。 • 分离：利用分离技术得到纯种。 • 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

16. 1. 采样 二、新种分离与筛选的步骤 （1）采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。

17. 1. 采样

18. 二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样 （2）采样季节 以温度适中，雨量不多的秋初为好。 （3）采土方式 在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。

19. 2. 增殖培养 二、新种分离与筛选的步骤 • 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。 • 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

20. 3. 培养分离 二、新种分离与筛选的步骤 • 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。

21. 4. 筛选 二、新种分离与筛选的步骤 • 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。

22. 5. 毒性试验 二、新种分离与筛选的步骤 • 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。 • 有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。

23. 6.培养分离中要解决的问题 二、新种分离与筛选的步骤 （1）“分离什么和从哪里分离出?” （2）必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。 （3）选择适宜的培养分离方法和检测方法。

24. 三、诱变育种 • 以微生物的自然变异作为基础的生产选种的机率并不很高，一个基因的自然突变频率仅10-6-10-10左右。 • 诱变育种：以诱发突变为基础的育种，是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。

25. 1. 诱变剂和诱变处理 三、诱变育种 • 物理诱变剂：射线如紫外线、X射线、γ射线，快中子； • 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很安全。 • 其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。

26. 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。 使用化学诱变剂的优缺点： （A）大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。

27. 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 使用化学诱变剂的优缺点： （B）化学诱变剂很经济，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射±行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 （C）大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。

28. （2）诱变剂的选择 三、诱变育种 1. 诱变剂和诱变处理 （A）碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，因为回复突变率高，效果不大。 （B）亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 （C）吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 （D）紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响邻近基因的性能。

29. 2. 诱变育种步骤 三、诱变育种 • 出发菌株的选择 • 处理菌悬液的制备 • 诱变处理 • 中间培养 • 分离和筛选

30. 3. 紫外线的诱变育种 三、诱变育种 • 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为2537A．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。

31. 三、诱变育种 3. 紫外线的诱变育种 • 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个/ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个/ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。 • 由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。

32. 4. 亚硝基胍诱变曲霉菌 三、诱变育种 • N-甲基-N‘-硝基-N-亚硝基胍(NGN，MNNG或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变作用。其精确的作用机制尚不很清楚，据认为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞内的DNA复制系统，从而诱发了变异。MNNG的诱变作用随pH的升高而增强。

33. 四、基因工程育种 • 基因重组育种：是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另—个细胞的方法。

34. 1.一个完整的基因克隆过程步骤 四、基因工程育种 • 获得待克隆的DNA片段（基因）； • 目的基因与载体在体外连接； • 重组DNA分子导入宿主细胞； • 筛选、鉴定阳性重组子； • 重组子的扩增与／或表达。

35. 四、基因工程育种 2.基因重组

36. 五、杂交育种 1. 细菌杂交 • 在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。 • 大肠杆菌中存着致育因子F，有F因子为F+，没有F因子称F-，F因子插入胞核质的一定位置上称Hfr细胞。 • F因子有明显的感染性，大肠杆菌的接合，实质上是F因子的转移，所以F+和Hfr称供体菌，而F-称受体菌。

37. 五、杂交育种 2. 酵母杂交育种技术 （1）酵母繁殖方式 • 酵母为单细胞型真菌，一般以出芽方式生殖，通常情况下，繁殖体为双倍体，但经过特定条件的诱导，可使其产生单倍体孢子并可出芽产生单倍体繁殖体。 • 单倍体细胞具α及ε两种交配型。两种交配型细胞经其细胞壁上特定的凝聚因子诱导而进行交配，恢复为双倍体；同一交配型细胞之间，则因细胞壁上凝集因子的存在而不能进行交配。 • 在生活过程中，酵母细胞还可以形成三倍体、四倍体、多倍体或非整倍体细胞。

38. 五、杂交育种 2. 酵母杂交育种技术 （2）酵母杂交 • 一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。 • 酵母的杂交方法有孢子杂交法、群体交配法、单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。

39. 六、原生质体融合育种 • 原生质体融合育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化技术，此外尚有原生质体诱变育种等。 • 原生质休融合育种是基因重组的一种重要方法。 • 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论会上提出来的。

40. 六、原生质体融合育种 1. 原生质体融合育种的特点 （1）杂交频率较高：细胞壁去除后在高渗条件下形成类似于球形的原生质体。 （2）受接合型或致育型的限制较小：二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。 （3）遗传物质传递更为完整：原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程

41. 1. 原生质体融合育种的特点 六、原生质体融合育种 （4）存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能性。 （5）有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株。 （6）提高菌株产量的潜力较大。 （7）有助于建立工业微生物转化体系。

42. 2. 原生质体融合育种步骤 六、原生质体融合育种 （1）标记菌株的筛选和稳定性验证。 （2）原生质体制备。 （3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 （4）涂布于再生培养基，再生出菌落。 （5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。 （6）生产性能筛选。

43. 3. 原生质体融合育种的要点 六、原生质体融合育种 （1）标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或／和抗药性菌株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。

44. （2）原生质体的制备 六、原生质体融合育种 3. 原生质体融合育种的要点 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁分离剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞，它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。

45. 4. 影响原生质体制备的因素 六、原生质体融合育种 （1）菌体的前处理：为了使酶作用的效果好一些，可将菌作一些前处理。如细菌加入亚抑制剂量的青霉素。 （2）菌体的培养时间：为了使细胞易于原生质体化，一般选择增殖期的菌体。 （3）酶浓度：对于不同种属的微生物，不仅对酶的种类要求不同，就是对酶的浓度也有差异。另外，最佳酶浓度还随不同的生长期的菌体而变化。

46. 4. 影响原生质体制备的因素 六、原生质体融合育种 （4）酶处理温度 （5）破壁时的pH值 （6）渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中，不仅起到保护原生质体免于膨裂，而且还有助于酶和底物的结合，渗透压稳定剂多采用甘露醇，山梨醇，蔗糖等有机物和KCl和NaCl等无机物。

47. 1. 开发新的代谢产物的途径 七、筛选新的代谢产物 • 从自然界分离新的微生物菌株，或采用新的检阅方法筛选新的代谢产物。 • 对已知微生物的代谢产物进行化学修饰。 • 利用微生物转化改造代谢产物的结构。 • 通过原生质体融合获得新的代谢产物。 • DNA重组技术。

48. 2. 筛选微生物新的代谢产物程序

49. 3. 筛选微生物代谢产物的方法 七、筛选新的代谢产物 (1)直接方法 • 为了尽快确定微生物代谢产物的利用前途，在体外试验测得活性后，可以将培养液的有效成分直接作用于机体，观察被测样品的疗效。 • 这种直接确定代谢产物用途的方法亦称动物体内治疗试验。