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Electroforesis

Electroforesis. La electroforesis es una técnica para la separación de mol éculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico. Factores de los que depende la velocidad de migración. la intensidad del campo el éctrico la carga neta de la molécula tamaño fuerza iónica viscosidad

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Presentation Transcript

  1. Electroforesis La electroforesis es una técnica para la separación demoléculassegún la movilidad de estas en un campo eléctrico

  2. Factores de los que depende la velocidad de migración • la intensidad del campo eléctrico • la carga neta de la molécula • tamaño • fuerza iónica • viscosidad • temperatura del medio en el cual las moléculas se están moviendo.

  3. Existennumerosasvariaciones de estatécnica Electroforesiscapilar. Electroforesisen papel. Electroforesis en gel de agarosa. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Isoelectroenfoque. Electroforesisbidimensional.

  4. Electroforesis en gel de poliacrilamida • La electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) presentan ventajas como: • ser químicamente inertes • estables en un amplio intervalo de pH, temperatura y fuerza iónica • fáciles de generar mediante la polimerización de acrilamida.

  5. CH3 CH3 N CH2CH2 N CH3 CH3 TEMED N,N,N',N'-Tetrametiletilenediamina (NH4)2S2O8 PSA PersulfatoAmónico S2O82– + e– SO42– + SO42– Inicia polimerización

  6. SDS-PAGE • Permite determinanr el peso molecular de las proteínas • La separación es función del tamaño (masa molecular) • Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido.

  7. 2-4% acrilamida 5-10 % acrilamida

  8. Desnaturalización de proteína SDS Se uneunamolécula de SDS porcada dos residuos de aminoácidos

  9. Cátodo(-) Ánodo(+)

  10. Agente reductor 2-mercaptoetanol que reduce los puentes disulfuro (Cys-S-S-Cys) a grupos tioles (Cys-SH), • Agentes caótropos, que como la urea, rompen puentes de hidrógeno.

  11. Métodos de tinción • Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE pueden ser visualizadas en el gel mediante diversos métodos de tinción: • fluorescencia • plata • azulcoomassie (masempleado, sensiblidad de 50 ng de proteína)

  12. Determinación del peso molecular Dp=48mm Df=84 mm Rf24= 48mm/84 mm Rf=Distanciaquemigraunadeterminadaproteína/Distancia que migra el frente del gel

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