1890 型 PCR 荧光分析仪

1. 1890型PCR荧光分析仪 介绍及应用

2. 临床方面的应用  疾病的临床早期诊断  建立病原体病分子诊断标准  疗效考评  指导制订感染性疾病合理治疗方案  了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况  医院、血站及防疫站的确诊  新药研究中药物的作用效果  研究Elisa方法的漏检率  病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导 遗传病诊断中的应用  等位基因检测  多基因遗传病的突变检测  基因表达异常所致遗传病检测 在肿瘤诊断中的应用  肿瘤相关基因表达的检测  肿瘤标志物（肽类激素和酶）  肿瘤耐药基因（MDR） 实时荧光定量PCR的应用

3. 何谓PCR ? 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

4. 试剂的定量原理： • Taqman水解探针定量 • Roche杂交探针定量 • 分子信标定量 • SYBR Green Ⅰ染料定量 Taqman 探针 分子信标 杂交探针 荧光能量 共振转移 Taqman探针、杂交探针、分子信标都是通过荧光能量共振转移 直接或间接的产生特定波长的荧光，使仪器能检测到

5. PCR的发展史 这项技术的发明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技术 公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮ Ａ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。 在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家 中也引起了强烈的反应。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后 把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短 短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛 的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技 术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。

6. PCR原理和方法: (一) 众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺 嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制 时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶--ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最 后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。 假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 　在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小 写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。 把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合 在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。

7. PCR原理和方法: (二) 第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让 ＤＮＡ模板变性变成单链。 　　第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分钟，引物就可以结合到模板上去。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，ＤＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC........…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。

8. 影响PCR特异性的因素 • 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。 • 减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。 • 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。 • 改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。 • 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。

9. 扩增反应可以无穷进行下去吗？ 答：不可以。因为经过一定的循环周期后需扩增的片段不再按指数增多而逐渐进 入平坡，进入平坡的循环次数，取决于起始时存在的模板拷贝数以及合成的DNA总量。 所谓平坡就是批PCR循环的后期，合成产物达0.3～1pmol时，由于产物的堆积，使原 来以指数增加的速率变成平坦的曲线。 • 造成PCR进入平坡的原因有：  引物和dNTP等消耗完毕  Taq酶失活  底物过剩  非特异性扩增产物的竞争  退火时产物的单链自己缔合  变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用 　（焦磷酸化，双链DNA）。 总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。

10. 实时荧光定量PCR的Ct值 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。由于所设阈值都很低，所以Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。由于是低浓度，影响因素小，误差没被放大，所以具有良好的重现性 由图我们也可以看出，在Ct值所在处重复性惊人的好。 Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。

11. 由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。由图可以看到当扩增越靠后定量的重复性就越差。主要是因为①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响。

12. 仪器的Ct值定量原理 纵坐标代Ct值 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 横坐标代表起始拷贝数的对数 固定循环数后，荧光信号与模板数成正比，但当固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

13. 高速的加热降温循环系统 采用长寿命的LED激发光源 可对PCR扩增全过程进行实时动态监测 无需开启PCR反应管，可避免在PCR期间及PCR之后产物污染，确保结果准确 可用三种不同报告染料同时用于一个样品，在单一反应中取得更多信息 全中文界面，灵活的程序设定、全面的分析和报告功能，全部参数可储存 可打印多个或单个样本报告 1890型PCR荧光分析仪的特点

14. 仪器主要技术规格 • 样本数： 32 • 反应管（光学玻璃管）长： 35mm • 容积（反应体积） 10-20ul • 温度范围： 40℃-98℃ • 温度控制： 1℃/S-10℃/S • 激发光波长： 470nm（LED） • 发射光波长： 530，640，710nm • 检测灵敏度： 可在一个基因组中检测单拷贝 • 软件操作系统： Win2000 • 输入电源/功率： AC220V 50HZ/800VA

15. 仪器工作原理（一）

16. 仪器工作原理（二） 　图一盖中的加热器在计算机控制下向热室中交 替注入热气和环境空气，热室中温度由风扇电机 搅匀，由于空气无有效质量，热室可以迅速达到 设置温度，由此进行PCR的温度循环。32个样品 在周向马达的带动下逐一经过信号采集的光学系 统，为采样的准确定位光学结构由丝杆马达进行 微调。由长寿命的LED光源(470nm)激发毛细 管中的荧光，该荧光通过一组复合滤镜和透镜分 别同时到3个接收器上(520nm,640nm,710nm) 完成了仪器的实时采样。

17. 强大的软件功能 • 参数设置功能（包括温度、时间、循环数、 升降温速率、检测通道选择） • 样本资料记录功能 • 文件运行显示功能（PCR热循环数据显示、荧 　　光检测数据显示） • 检测数据分析功能 • 分析结果输出功能 • 故障保护和报警功能

18. 先进的光路系统 • 选用长寿命LED激发,无需预热，无需校正 • 采用了先进的非球面镜设计，提升了仪器的光学性能，缩短了光程，使仪器更小巧 • 优质的滤光片，硬膜镀膜技术，窄带低背景高透过率不霉变 • 实时三色荧光检测，尽善尽美

19. 传统96孔板和离心毛细管比较 毛细管 96孔板 标本量小，耗材成本稍高  标本量大，耗材成本低 由于离心，每个样品孔间温度 由于加热模块的边缘效应，每个 均匀一性好 样品孔间温度存在差异 加热介质空气与反应体系无缝 96孔板反应面积大，故升降温 接触，接触面积大，故升降 速度慢 温速度快 一个40个循环的实验只需30-45 一个40个循环的实验需要2小时 分钟 光源与检测器对每个样品来说 每个样品孔距离光源和检测器 是等距离的，减少了系统误 光程不同，可能对结果产生 差 影响

20. 　　由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。　　由于定量PCR必须借助于样本和标准品之间的对比实现定量，旋转的样品架很好地解决了样品孔间的均一性，最大程度的保证了标准曲线与样品之间条件的一致性，避免了微小差别被指数级发大。

21. 优异的灵敏度 宽广的线性动力学范围 仪器能在7个数量级的范围内得到非常好的线性结果。相关系数（r）可达3个9。且有优异的灵敏度和极佳的重复性

22. 友好方便的操作界面

23. 方便的样品编辑界面

24. 方便的温度循环设置界面

25. 一目了然的运行界面 ●时实反应了当前样品室的温度曲线。 ● 指示当前温度曲线位置的温度，循环数及第几程序段。 ●时实反应了当前的荧光信号

26. 方便的数据处理界面 两种分析方法： ●方差法 ●最小二乘法 标准曲线拟合 ： ●自动标准曲线拟合 ●自动计算相关系数

27. 个人信息输入和打印报告格式 综合检测报告 病人检验报告

28. 1890型PCR与国内外仪器比较