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扬州五台山医院 张晓斌

抗抑郁药物以及抑郁症与胶质 源性神经生长因子的关系. 扬州五台山医院 张晓斌. 抑郁症的流行病学. 全球有抑郁症患者约 1.2-2.0 亿 WHO （ 1996 ）在中国的调查发现抑郁症的患病率已经达到 7% 到 2020 年，抑郁症在全球疾病总负担中将升至第二位 我国有超过 2600 万人患有抑郁症，造成直接和间接经济损失每年超过 640 亿元人民币 抑郁症引起的精神残疾给患者、家庭和社会带来了沉重的负担，而在其支配下的自伤、自杀、扩大性自杀等暴力行为更是危害巨大. 抑郁症病因. 遗传因素 家系研究、双生子研究、分子遗传学研究

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  1. 抗抑郁药物以及抑郁症与胶质 源性神经生长因子的关系 扬州五台山医院 张晓斌

  2. 抑郁症的流行病学 • 全球有抑郁症患者约1.2-2.0 亿 • WHO（1996）在中国的调查发现抑郁症的患病率已经达到7% • 到2020年，抑郁症在全球疾病总负担中将升至第二位 • 我国有超过2600万人患有抑郁症，造成直接和间接经济损失每年超过640亿元人民币 • 抑郁症引起的精神残疾给患者、家庭和社会带来了沉重的负担，而在其支配下的自伤、自杀、扩大性自杀等暴力行为更是危害巨大

  3. 抑郁症病因 • 遗传因素家系研究、双生子研究、分子遗传学研究 • 神经生物学因素神经传递异常、神经生理异常(睡眠)、神经内分泌异常 • 素质和躯体因素体质体型学说、早年经历和人格特点、躯体状况和疾病 • 心理社会因素

  4. 抑郁症的病理机制假说 • “三个”假说 • 单胺神经递质（5-HT、NE和DA）的缺乏 • 单胺递质缺乏引起相应受体上调 • 神经可塑性：神经再生受损，海马体积减少

  5. 抗抑郁剂的作用示意图

  6. 3维脑影像显示海马体积：有抑郁史者减少大约10%3维脑影像显示海马体积：有抑郁史者减少大约10%

  7. Reduced Glia inMDD & BPD ● Density/size of glia in dorsolateral prefrontal cortex and caudal oribito frontal cortex in MDD & BPD-layer specific (Miguel-Hidalgo and Rajkowska 2002; Rajkowska et al 1999) ● Glial cell density in sublayer IIIc (19%) (and a trend to decrease in layer Va) in dorsolateral prefrontal cortex (area 9) in BPD (Selemon, unpublished data) ● Glial number in subgenual prefrontal cortex in familial MDD (24%) and BPD (41%) (Ongur et al 1998) ● Glial cell density in layer V (30%) in prefrontal cortex (area 9) in MDD (Cotter et al 2002) ● Glial cell density in layer VI (22%) in anterior cingulate cortex in MDD (Cotter et al 2001) ● Glial cell counts, glial density, and glia-to-neuron ratios in amygdala in MDD (Bowley et al 2002)

  8. 星形胶质细胞的生理功能 1、成年脑中近90 %的细胞是胶质细胞,其中主要是星型胶质细胞(ast rocytes , AS)， AS 长期以来被认为是脑组织中简单的堆积物，发挥着连接、支持、固定脑组织的作用，为神经元提供营养以及清除突触间隙中过多的离子和/ 或神经递质。2、1997 年Pfrieger 等首次报道AS能强烈促进神经元间的突触联系后，对AS的认识进入了一个崭新的阶段。一系列对于AS 的研究证实:AS还可以调节神经元的周围环境,分泌神经营养因子（如：GDNF、BDNF、NGF、NT3/4等 ），参与血脑屏障构成, 调节神经元突触的生长和功能成熟，调控神经的发生，参与脑中信号传递等。 3、 AS能够回吸收5-羟色胺（5-HT），在AS细胞膜存在有5-HT和类固醇受体。

  9. 胶质源性神经生长因子（GDNF）生理特点 1、1993年Lin等从大鼠B49胶质细胞系中分离、纯化并成功克隆。人的GDNF基因位于5P13.1-13.3,大鼠与人的GDNF氨基酸序列有93%相同。 2、GDNF以前体形式合成，修饰为含134个氨基酸的成熟蛋白形式分泌。GDNF含7个保守的半胱氨基酸残基，GDNF为TGF- β超家族的一员。 3、GDNF 的神经营养作用主要是通过胶质细胞源性神经营养因子受体alpha( GFRαs) 亚基和受体酪氨酸激酶Ret 亚基结合，并引起酪氨酸残基自磷酸化, 从而引起下游的信号转导。 4、GDNF的生理功能：对运动神经元、感觉神经元、多巴胺神经元的营养支持； GDNF对缺血性损伤的保护作用；在痛觉通路中发挥作用；参与血-脑屏障的形成。

  10. 抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（ECT ）的可能机制 1、不同类型的抗抑郁药能够促进神经病胶质瘤C6细胞株分泌GDNF， GDNF的分泌量与抗抑郁药干预存在时间和浓度的依赖。 2、抗抑郁药（氟西汀）能够阻断应激导致的大鼠模型中星型胶质细胞的体积和数目的减少。 3、情感稳定剂（如：碳酸锂、丙戊酸盐）能够使抑郁大鼠模型中mRNA BDNF表达上调。 4、电休克的治疗作用与神经胶质细胞可能有部分联系。 在电休克治疗的动物模型的齿状回等脑区GFAP（神经胶质酸性蛋白）表达与合成增加。 抗抑郁剂、情感稳定剂及电休克治疗（ECT ）对抑郁的治疗作用可能是通过星型胶质细胞来发挥效果？

  11. 研究目标 本课题拟做如下研究： 1、给予纯化培养的大鼠海马星型胶质细胞氟西汀处理，ELISA检测星型胶质细胞分泌的GDNF水平、real-time PCR检测mRNA GDNF的表达。 2、 建立应激大鼠模型，给予氟西汀干预后， 来研究星型胶质细胞的数目和密度。通过real-time PCR和WestBlot分别检测mRNA GDNF和GDNF蛋白的表达。 3、 ELISA检测抑郁症患者抗抑郁药和电休克治疗前后血清GDNF水平的变化。

  12. 实验技术路线（1） 出生24小时的SD大鼠 星型胶质细胞的纯化培养和鉴定 空白对照组 氟西汀干预组 不同时间点 不同药物浓度 0 6 12 24 48(H) 0 1 10 25(uM) ELISA、real-time PCR

  13. 实验技术路线（2） 对照组 无应激 GDNF mRNA表达 GDNF蛋白的表达 对照组+ 氟西汀 氟西汀 应 激 应激组 应激组+ 氟西汀 应激+氟西汀 21 days

  14. 治疗前 治疗4周 治疗8周 GDNF浓度 HDRS评定 GDNF浓度 HDRS评定 GDNF浓度 HDRS评定 抑郁症患者 MECT前 MECT后 难治疗性抑郁症患者 GDNF浓度 HDRS评定 GDNF浓度 HDRS评定 实验技术路线（3）

  15. 实验方案 1、大鼠海马星型胶质细胞的培养、纯化和鉴定 海马的分离：机械法分离出大鼠海马—胰酶消化法收集单个细胞 培养和纯化：将细胞种植于包被多聚赖酸的培养瓶中，使用含20%FBS的DMEM/F12培养液培养细胞。采用差速贴壁和传代法纯化星型胶质细胞。 鉴定：通过细胞免疫化学法标记星型胶质细胞特异性表达的细胞骨架蛋白-GFAP 。

  16. 实验方案 2、探讨对海马星型胶质细胞产生最佳作用的氟 西汀药物浓度 星型胶质细胞的培养、纯化 探讨氟西汀的最佳药物浓度：使用MTT法检 测不同浓度氟西汀（0-50μM）对星型胶质细胞存活力影响。

  17. 实验方案 3、在不同时间点，氟西汀药物对海马星型胶质细胞的作用 星型胶质细胞的培养、纯化 不同浓度的氟西汀作用星型胶质细胞48h后 同一浓度的氟西汀（最佳浓度）作用星型胶质细胞不同时间后（0-6-12-24-48h后） 检测指标： ELISA检测细胞培养液中GDNF水平、real-time PCR检测mRNAGDNF表达。

  18. 实验方案 4、应激大鼠模型层面的研究 实验动物选取：选取清洁级健康成年雄性SD大鼠，12月龄，体重275(±25) g，大鼠经Y型迷宫测试，选择活跃，对电击反应较敏感，逃避反应迅速，达到连续2次正确反应、电击次数≤3次者供实验用，同时排除过度活跃和反应迟钝的大鼠。 应激模型的建立：按Willner等方法改良的CUMS和孤养法建立应激模型，孤养同时连续随机给予CUMS。 实验动物分组：对照组、对照组+氟西汀、应激组、应激组+氟西汀。 检测指标：使用Real-time PCR、 Western blot分别检测海马区mRNA GDNF和 GDNF蛋白表达。

  19. 实验方案 5、临床层面的研究 研究对象 抑郁症组(76例)：选择住院病人，均符合CCMD-3复发性抑郁症的诊断标准。 难治性抑郁症组(16例)：符合CCMD-3复发性抑郁症诊断标准，并符合难治性抑郁的临床定义：至少对三种抗抑郁药在足剂量和足疗程时无治疗效果。 正常对照组(50例):与患者组性别、年龄相匹配，无烟酒嗜好、无酒精药物成瘾和其他精神神经科疾病。 量表评定：采用汉密尔顿抑郁量表(HDRS)评定抑郁症状严重程度、。 无抽搐电休克治疗：采用美国产SPECTRUM 5000型无抽搐电休克治疗仪，治疗约8-10次。 血清GDNF浓度测定：采不抗凝的空腹静脉血5ml，分离血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清GDNF浓度。

  20. 实验方案 6、统计学检验 用SPSS统计软件包处理所有实验数据，求出各组观察指标的均值和标准差；用方差分析、t检验或非参数学分析比较各组各定量指标；用χ2检验比较各组间定性指标。

  21. 实验结果(1) 细胞层面的研究

  22. 细胞照片 5天 6天 2天 P0原代细胞

  23. 细胞照片 6天 6天 P4传代细胞

  24. 星形胶质细胞免疫组化照片

  25. 星型胶质细胞免疫荧光组化照片

  26. 不同浓度氟西汀对星型胶质细胞活性影响 与0μM浓度组比较，★P<0.05，★★P<0.01

  27. 同一浓度氟西汀干预星型胶质细胞 不同时间后对GDNF水平的影响 与同时间组比较，★★P< 0.01

  28. 不同浓度氟西汀对星型胶质细胞所分 泌的GDNF水平的影响 与0μM、1μM浓度组比较，★P<0.05

  29. 氟西汀对星型胶质细胞作用的后遗效应 药物作用48h后，与0μM浓度组比较，★★P<0.01；撤药24h后，与 原0μM浓度组比较，★P<0.05，★★P<0.01

  30. 氟西汀对GDNFmRNA表达水平的影响 与0μM、1μM、5μM浓度组比较，★★P<0.01；与10μM浓度组比较★P<0.05

  31. 实验结果(2) 动物层面的研究

  32. 各组大鼠的糖水消耗 应激第21天后抑郁组与对照组、对照加药组及抑郁加药 组相比，★P<0.05

  33. 应激第21天后抑郁组与对照组、对照加药组及抑郁加药组相比，★★P<0.01，★P<0.05 各组大鼠的旷野试验得分

  34. GDNF mRNA表达水平 与对照加药组相比，★★P<0.01；与对照组相比，★P<0.05

  35. β-actin GDNF GDNF蛋白表达水平 对照组对照加药组抑郁组抑郁加药组 各组大鼠海马区GDNF蛋白表达图片

  36. 实验结果(3) 抑郁症患者层面的研究

  37. 抑郁症患者抗抑郁药物治疗前后血清GDNF浓度的比较抑郁症患者抗抑郁药物治疗前后血清GDNF浓度的比较 与治疗前血清GDNF浓度比较，★★P<0.01

  38. 难治性抑郁症患者MECT前后血清GDNF浓度的比较

  39. 与治疗前比较，★P<0.05

  40. 请 提 宝 贵 意 见 谢 谢 大 家

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