六 光度测定法技术 ( 选讲内客 )

1. 六光度测定法技术(选讲内客) 授课人:汪穗福(高级讲师) 苏惠虹(助理讲师) 广州市医药中专学校

2. 六光度测定法技术(选讲内客) （一）概述 光度测定法分为浊度法和显色基质法。浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变法而测定内毒素含量的方法。 根据检测原理,可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法的原理是反应混合物的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度(吸光度或透光率)之间存在着量化关系。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增长速度的方法。

3. 显色基质法是检测鲎试剂与内毒素反应时从选定的显色肽中释放出的有色团。显色基质法是检测鲎试剂与内毒素反应时从选定的显色肽中释放出的有色团。 根据检测原理，分为终点显色法和动态色法。终点显色法的基础是反应混合物的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的数量之间存在的量化关系。 动态显色法是检测反应混合物的颜色到达某一项预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测颜色增长速度的方法。

4. 所有的光度测定试验都要求在特定的仪器(如图5－13、5－14)中进行，温度一般为37±1℃。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。所有的光度测定试验都要求在特定的仪器(如图5－13、5－14)中进行，温度一般为37±1℃。供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。 为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品溶液的干扰试验。

5. 英国Lab Kinetics 公司 ATi-320动态试管仪, 32孔，可变波长 BET－72型细菌内毒素检查法（定量法用）测定仪（天大天发科技有限公司研制 )

6. （二）光度测定法的实验程序 1 试剂仪器用具等的试验准备－→ 2 研定药品细菌内毒素的限值（L）－→ 3 选择定量鲎试剂－→ 4 计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度（MVC）－→

7. 5 标准曲线的可靠性试验－→ 6 药品与鲎试剂相容性的初筛试验－→ 7 供试品干扰试验及验证－→ 8 供试品日常的内毒素定量检查。 → → → → →

8. 定量法操作开机准备工作

9. （三）标准曲线的可靠性试验 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。 用标准内毒素配成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。

10. 标 准 曲 线 的 制 备 程 序 稀释为至少3个等比系列稀释液，稀释度2~10倍（如此而4λ、2λ、λ或100λ、10λ、λ稀释液，λ为最低浓度） 封口，混匀 内毒素 → 复溶 → → ↓ 鲎试剂 复溶 反应管，每个浓度平行3管 → → ↓ 内毒素测定仪： 预热 → 封口，混匀 → ↓ 插入反应器 ↓ 结果判断及数据处理

12. 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数|r|的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数|r|的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。

13. 试验 通常在干扰试验进行之前先做药品与鲎试剂相容性的初筛试验[目的：确定供试品无干扰的稀释倍数范围（或浓度范围）]。其初筛试验程序是： (1) 记录: ①供试品名称、浓度C（或干粉重量及溶解后浓度C）； ②最大人体剂量M (查阅中国药典、USP、EP或有关研究药品鲎试验的文献) (2)计算供试品的内毒素限值 L=K/M。(3) 选择试剂：①TAL或LAL（抗干扰能力、缓冲能力、灵敏度、阴性控制、溶解性等）； ②　BET水（内毒素含量小于0.005Eu/ml）；③　RSE或CSE（经RSE标化）；

14. (4) 计算：供试品的最大有效稀释倍数MVD=L/λ或最低有效浓度MVC=λ/L=C/MVD； (5) 选择标准曲线的内毒素浓度范围（2～10倍等比稀释系列，如：4λ、2λ、λ；100λ、10λ、λ）； (6) 确定PPC的内毒素浓度λm （标准曲线的中点浓度）； (7) 确定初步筛选的供试品的稀释倍数范围或浓度范围。 (8) 制备：①　标准内毒素系列（用BET水稀释的内毒素标准溶液）；②NPC稀释系列（不含内毒素的供试品稀释系列）；③PPC稀释系列(含标准曲线中点浓度内毒素λm的供试品稀释系列)

15. (9) 反应：　在ATi系统或BET－72型测定仪的反应器内进行。①　标准曲线：TAL＋ES系列（至少三个内毒素浓度，平行二管）；②　PPC ：TAL＋含中点内毒素λm的供试品稀释液（平行二管）； ③　NPC ：TAL+供试品稀释液（平行二管）；　④　NC：TAL+BET水（平行二管）。 （10）数据处理：回收率＝ES－Et／λM×100%。　在测定仪中数据处理的回收率计算机自动计出。 （11）结果判断： 标准曲线：|r|≥0.980，有效，PPC：回收率50%～200%，无干扰， NC的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，有效， PPC：测定值在标准曲线范围内，有效。

16. 当以上初筛试验得出回收率在50%～200%的浓度后，就以该浓度进行正式的干扰试验操作。当以上初筛试验得出回收率在50%～200%的浓度后，就以该浓度进行正式的干扰试验操作。 其步履是：选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（以初筛试验得出回收率在50%～200%的浓度），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。 按表5－9制备溶液A（NPC）、B（PPC）、C（3个浓度的标准曲线）和D（NC）。 供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。每种溶液至少做2个平行管。

17. 编号 内毒素浓度 加入内毒素的溶液 平行管数 A 无 供试品溶液 不少于2个 B 标准曲线的中点 (或 附近的点) 的浓度（ 供试品溶液 不少于2个 设为λm） C 至少3个浓度(最低一 检查用水 每一浓度不 点设定为λ) 少于2个 D 无 检查用水 不少于2个 注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。 B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度）的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。 C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。 D为阴性对照。

18. 按所得线性回归方程分计算机出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。按所得线性回归方程分计算机出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。 R = [(Cs-Ct)/λm ]×100% 当内毒素的回收率在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素。并要重复干扰试验来验证处理的有效性。

19. 干扰试验

20. 当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。 （五）样品定量检查法 按“光度法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。试验必须符合以下三个条件方为有效： （1）系列溶液C的结果要符合“光度技术预试验”下的“标准曲线的可靠性试验”中的要求；（2）用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50～200%的范围内。(3）溶液D的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

21. 结果判断　　若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。结果判断　　若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判供试品不符合规定。 • 注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。

22. （六）光度测定法技术测定结果实例 清开灵注射液的动态浊度法检测研究实例,见式5-10，5-11。 表5-10:清开灵注射液标准曲线的可靠性 内毒素浓度C（EU·ml）平均反应时间T（S）变异系数CV（%） 2.0 371．4 2.488 0.25 739．2 1.249 0.03 1581．0 8.433 NC >3600 0.00 　回归方程： lgT=0.891212-0.344495lgC，r=-0.997336，最低标准内毒素浓度为0.0298EU·ml-1，反应时间在371.4～1581.0之间，阴性对照反应时间＞3600s，在检测时间外，（反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间）故标准曲线成立。

23. 表5-11: 清开灵注射液1：32和1:64倍稀释液的干扰试验结果： 样品批号 稀释 检查项目 平均反应 内毒素平均值 回收率 ％CV 倍数 时间(s) (EU·ml-1) (﹪) 32 NPC 1209 2.5726 3.509 32 PPC 767.7 10.7621 102.4 5.804 • 64 NPC 2229 0.7642 6.662 64 PPC 790.5 19.4203 116.6 1.342 32 NPC 2206.5 0.2114 5.288 32 PPC 754.8 6.9491 84.2 2.810 MB3008 64 NPC 0.000 0.000 64 PPC 777.3 12.6018 78.8 1.364 32 NPC 2011.5 0.2834 1.582 32 PPC 732.3 7.6548 92.1 1.448 MB3210 64 NPC 1617.6 0.0601 7.689 64 PPC 785.4 12.3084 76.6 5.491 NC > 3600

24. 批号020930 回归方程为lgT=0.954417-0.319067lgC，r=-0.995158；批号MB3008、MB3210回归方程为lgT=0.896189-0.306447lgC，r=-0.998750。

25. 系列溶液管的反应曲线

26. 系列溶液管的检查反应结果

27. 测试题 是非题: (指出错误的地方和改正错题) 1. 根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应小于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。 2．光度法的干扰试验结果判断成立的条件是：标准曲线：|r|≥0.980，有效， PPC：回收率50%～200%，无干扰，NC：全部小于最低浓度λ，有效，PPC：测定值在标准曲线范围内，有效。( ) 3.光度法中的λm 表示的是标准曲线的中点浓度。( )

28. 把浓度为150EU/ml的工作标准品稀释为10，1.0，0.1和0.01EU/ml四个浓度，应如何顺序进行稀释。把浓度为150EU/ml的工作标准品稀释为10，1.0，0.1和0.01EU/ml四个浓度，应如何顺序进行稀释。 EUmlml ml ml 200EU/ml－→10EU/ml－→1．0EU/ml－→0．1EU/ml－→0．01EU/ml 检查用水ml ml ml ml