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第五章 诊断酶学

第五章 诊断酶学. 退出. 主要内容. 一、酶的一般特征. 五、 酶的免疫化学测定. 二、血清酶. 六、 同工酶和亚型的测定. 三、酶促反应动力学. 七、工具酶及其临床应用. 八、临床常用血清酶及其同工酶. 四、酶活性浓度测定技术. 第一节 酶的一般特征. 一、基本概念. 二、酶的结构与催化作用. 三、酶的命名分类及编号. 返回章. 一、基本概念. 1. 酶、核酶。 2. 酶的催化特性 :极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。 3. 酶促反应: 酶所催化的反应。 酶活性: 酶催化反应的能力。 底物 (S) : 酶所作用的物质。

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第五章 诊断酶学

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  1. 第五章 诊断酶学 退出

  2. 主要内容 一、酶的一般特征 五、 酶的免疫化学测定 二、血清酶 六、 同工酶和亚型的测定 三、酶促反应动力学 七、工具酶及其临床应用 八、临床常用血清酶及其同工酶 四、酶活性浓度测定技术

  3. 第一节 酶的一般特征 一、基本概念 二、酶的结构与催化作用 三、酶的命名分类及编号 返回章

  4. 一、基本概念 1. 酶、核酶。 2. 酶的催化特性:极高的催化效率、高度的特异性、催化作用的可调节性。 3. 酶促反应:酶所催化的反应。 酶活性:酶催化反应的能力。 底物(S):酶所作用的物质。 产物(P):酶促反应的生成物。 酶的激活剂:加速酶促反应的物质。 酶的抑制剂: 减慢或终止酶促反应的物质。 返回节

  5. 二、酶的结构与催化作用 单纯酶和结合酶 单纯酶:只含多肽链,是单纯蛋白质。 结合酶:由酶蛋白和辅因子组成。 两者结合后形成的复合物称为全酶。 与酶蛋白结合疏松的称为辅酶。 与酶蛋白结合牢固的称为辅基。 酶的活性中心   酶与底物结合并将底物转变成产物发生在酶表面的一个特定区域。 酶的催化作用机制    诱导契合学说。 返回节

  6. 三、酶的命名、分类及编号 返回节

  7. 第二节 血清酶 一、血清酶的来源 二、血清酶的去路 三、血清酶的生理变异 四、血清酶变化的病理机制 返回章

  8. 一、血清酶的来源 血浆特异酶   为血浆蛋白的固有成分,在血浆中发挥特定的 催化作用。多数由肝脏合成并以酶原形式分泌入, 在一定条件下被激活起作用。与凝血有关的酶或酶 原、ChE、Cp及LPL等。 非血浆特异酶 外分泌酶:由外分泌腺合成并分泌进入血浆的 酶,包括P-AMY、P-LPS、前列腺ACP等。 细胞内酶:存在于细胞内进行物质代谢的酶, 随着细胞的不断更新或破坏可少量释入血液。当其 大量出现于血清中时,提示酶的来源组织细胞受 损,最常用于临床诊断。 返回节

  9. 二、血清酶的去路 血清酶的半寿期 (T1/2) 定义: 酶失活至原来一半时所需时间。 半寿期代表酶从血中清除的快慢。半寿期长的酶,在血清中持续时间长。 血清酶的失活和排泄 酶的清除主要是在血管内失活或分解。 血清酶经蛋白酶水解产物(多肽或氨基酸) 可经小肠粘膜排至肠腔,再彻底分解成氨基酸后被重吸收,其中大部分可被组织利用,不能利用的氨基酸则随尿排出体外。 返回节

  10. 三、血清酶的生理变异 1.性别 少数酶如CK、ALP及GGT等有性别差异,与血清酶的 来源组织有关。 2.年龄 血清酶的活性随年龄而变化,ALP和GGT到老年时可有 轻度升高。年龄差异也见于同工酶。 3.进食 过量饮酒可使血清GGT明显升高。 4.运动 多种血清酶活性升高,如CK、LD、AST、ALD和ALT 等,其升高的幅度与运动量、持续时间、运动频率及 骨骼肌所含的酶量有关。 5.妊娠 胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液,如耐热ALP、 LD、LAP和ALT(少数)等,引起血清中这些酶活性升 高。 6.其他 一些酶活性与体重、身高的增长、体位改变、昼夜变 化及家庭因素有关。 返回节

  11. 四、血清酶变化的病理机制 酶合成异常 • 合成减少 • 合成增多 酶释放增加:大多数血清酶增高的主要原因 • 细胞内外酶浓度差异 • 酶蛋白分子量的大小 • 酶的组织分布 • 酶在细胞内定位和存在形式 酶的清除异常   不同疾病和不同的酶从血中清除时间和机制不同。 如AMY和ALP经肾脏或胆道排出异常而致血清酶升高。 返回节

  12.  第三节 酶促反应动力学 一、米-曼氏方程 二、Km与Vmax 三、酶促反应进程曲线 四、影响酶促反应的因素 返回章

  13. 一、米-曼氏方程 • Michaelis 和Menten提出的酶作用的中间产物学说: K1 K3 E+S ES E+P K2 • 1913年提出了著名的酶促反应速度与底物浓度关系的 方程式,即米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation): 返回节

  14. 二、Km与Vmax Km值:等于酶促反应的初速率为最大速率Vmax一半 时的底物浓度,即V=½Vmax时,则Km=[S]。Km 在临床上的应用:   反映酶与底物的亲合力,且与亲合力成反比。 用来计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最     大反应速度的百分率。   根据Km值选择酶的最适底物。 确定工具酶用量。 确定代谢酶系中的限速反应和作为鉴别酶的依 据。 Vmax:酶完全被底物饱和时的反应速度,代表了在一 定酶量下的最大反应速率。 返回节

  15. 酶促反应时间进程曲线(S为底物,P为产物)

  16. 三、酶促反应进程曲线 底物耗尽期 线性反应期 ——必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。 延滞期 如将酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]变化量对时间作图,可得酶促反应时间进程曲线。图中产物[P]或底物[S]变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。 返回节

  17. 四、影响酶促反应的因素 底物浓度对酶促反应的影响 (1)当[S]<<Km时,反应速率与底物浓度[S]成正比,呈一级反应, V=Vmax[S]/Km=K[S] 用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。 (2)当 [S]>>Km时,反应速率与底物浓度[S]无关, V=Vmax=K [E] 称为零级反应,反应速率与酶浓度[E]成正比。酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10~20倍。 返回节

  18. 常见酶温度转化系数

  19.  第四节 酶活性浓度测定技术 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度(v)达到最大速度Vmax,即在过量底物存在下的零级反应期的速度,此时反应速度与酶浓度[E]之间存在线性关系。 一、酶活性浓度测定方法 二、酶偶联法 三、血清酶活性浓度测定条件的选择 四、酶活性浓度的单位 五、系数K值的计算与应用 六、临床酶学测定的标准化 返回章

  20. 一、酶活性浓度测定方法 1.按反应时间分类: 定时法 连续监测法 2.按检测方法分类: 量气法、分光光度法、荧光法 其它方法( 放射性核素法、离子选择电极法,旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等)。 返回节

  21. 按检测方法分类——底物或产物浓度的检测 返回节

  22. 定时法(固定时间法) 测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量,计算酶促反应平均速度。 • 优点:比较简单,最后测定时因酶促反应已被终止,故所用仪器无需恒温装置,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 • 缺点:无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。 利用该法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确,否则会引起较大误差。 返回节

  23. 连续监测法 又称速率法或动力学法,指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间 的变化量,求出酶反应初速度,间接计算酶活 性浓度的方法。 • 优点: 无须终止酶促反应,不需添加其它成色试剂, 就反应物变化的多点测定结果连接成线,观察 到整个反应过程,选择线性反应期来计算酶活 性,结果准确可靠。 要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能,自动生化分析仪都能达到这些要求。 返回节

  24. 连续监测法的种类 直接法 是指待测酶酶促反应的底物或产物有特征性的理化性质,然后通过特殊的仪器直接检测。 • 基于NADH或NADPH的反应原理 :LD、α-HBD等 • 基于人工合成色素原底物 :ALP 、GGT、AMS等 • 基于氧的消耗 :各种氧化酶 间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质,需通过另一个化学反应或生化反应,将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物。用直接法来测定的酶类非常有限,很多情况下不得不使用间接法。 • 化学法:如ChE的丁酰硫代胆碱测定法。 • 酶偶联法 返回节

  25. 二、酶偶联法 酶偶联反应 最简单的模式为: Ex 为待测酶,A为底物,B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测,此时可外加第二个酶Ei(为指示酶),其底物为B,反应产物为P可直接测定。 返回节

  26. 辅助反应 如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联,此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶,将二者连在一起,此反应称为辅助反应。模式为: 其中,B、C均为中间产物,Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei,其他外加的酶都为辅助酶(Ea)。 返回节

  27. 酶偶联反应原理 (1)当用酶偶联法测定时,在偶联反应中存在几个时期: 预孵育期、延滞期、恒态期、非恒态期。 (2)延滞期是酶偶联反应与一般酶反应的一个重要区别。从酶反应开始至稳态期间,指示酶反应较慢且不稳定,称为延滞期。在这期间指示酶反应速度不能代表测定酶量多少。 (3)设计和选择酶偶联测定方法时,延滞期越短越好,测定时间要避开此期。 返回节

  28. 酶偶联法测定ALT的吸光度变化图 返回节

  29. 对酶偶联反应的要求 指示酶反应必须是一级反应 酶反应速度与指示酶底物浓度相关。工具酶催化的最大反应速度必须远远大于测定酶,其所催化的反应必须在中间产物浓度很低的条件下进行,并且将此很快转变为最终产物,反应体系中不应有中间产物堆积,否则导致误差。 工具酶 作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性的酶称为工具酶。 返回节

  30. 指示酶、辅助酶的浓度计算方法一  根据Vx/(Km)x:Vi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量Vi,式中Vx为测定酶的测定上限。 比值为1:10、 1:100、 1:1000时, 误差28%、 4%、 0.7%。 实例:  在肌酸激酶测定法中,CK的Km为2.4mmol/L,指示酶G-6-PD的Km为0.27mmol/L,如将CK测定上限定为450U/L(实际测定时标本稀释60倍,实际为7.5U/L),如希望上述比例为1:100。代入上式: Vx/(Km)x:Vi/(Km)I=1:100 Vi=3.1×10-3×min-1×0.27mmol×100 =8.37×10-2×mmol×min-1 ×L -1 =83.7U/L 如反应体系为1ml,只需0.0837U的G-6-PD 即可。 返回节

  31. 指示酶、辅助酶的浓度计算方法二 根据米氏方程式来计算,在酶偶联反应中,指示酶催化速度(Vi) 的 米氏方程式为:   以天冬氨酸氨基转移酶(AST)为例希望中间产物P浓度很低,定为0.001mmol/L,指示酶苹果酸脱氢酶Km为0.0165mmol/L,如设定AST上限为300U/L(标本为1:12稀释,实测上限为25U/L)。代入上式: Vi=0.0014mmol min-1=1.4U 得1.4U,如反应体系为3ml,则试剂中苹果酸脱氢酶用量为466U/L,目前试 剂中用量为600U/L。从以上计算来看,试剂中用量是足够的。 返回节

  32. 三、血清酶活性浓度测定条件的选择 方法条件的选择 尽可能采用连续监测法;减少步骤, 化学试剂有一定纯度,双蒸水,使用双试剂。 测定参数的设置 方法类型、波长、样品量与试剂量、 稀释水量、试剂吸光度上下限、空白速率、反应孵育时 间、延迟,监测时间、底物耗尽限额、线性范围及计算 因子F值。 标本的采集、运输与保存 影响因素:溶血、抗凝剂、温度等。 干扰因素的控制 反应干扰。污染。底物自行发生反 应。 返回节

  33. 不同贮存温度时体液酶的稳定性 *酶不耐融化;§与同工酶类型有关;※标本未酸化;#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5

  34. 四、酶活性浓度的单位 酶活性单位 • 惯用单位惯用单位是酶活性测定方法的建立者所规定的单位。由于单位定义不同,参考范围差别很大,难以进行比较。 • 国际单位(IU) 在特定的条件下,每分钟转化1mol底物的酶量为一个国际单位。 以IU表示,1IU=1mol.min-1。 • Katal单位在规定条件下,每秒钟转化1mol底物的酶量为1kat, 1kat=1mol.s-1。常用单位为katal或 nkatal。 Kat与IU的换算关系为: 1IU=1mol·min-1=16.67nmol·s-1= 16.67nkatal 返回节

  35. 酶活性浓度单位 临床上酶活性浓度采用每单位体积(升)所含的酶活性单位数表示。 酶活性浓度单位的计算 连续监测法根据摩尔消光系数进行酶活性浓度的计算。 公式如下: 返回节

  36. 参考范围与正常上限升高倍数(ULN) 由于临床实验室进行酶学测定时所选仪器、试剂和方法不同,加之生物学变异等对酶活性影响,常常导致实验室之间所得参考范围差别甚远,应根据各自情况对各种酶建立自己的参考值。 所谓正常上限升高倍数(ULN)是指用测得的酶活性结果除以参考范围上限 。 便于比较来自不同方法的结果;如将ULN进一步适当分级,更制定出轻度、中度及极度增加的范围,一目了然。有些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时,用ULN换算更能正确表达,就不致发生误判。 返回节

  37. 临床常用血清酶的测定方法与参考范围(37℃)临床常用血清酶的测定方法与参考范围(37℃) *国际临床化学联合会(IFCC)参考方法;#实际为拟胆碱酯酶(PChE) 返回节

  38. 五、系数K值的计算与应用 用自动生化分析仪测定同一酶,条件固定时,从理论上来讲V、v和L均为固定值,为常数,则将公式 简化为 如LD活性浓度,已知NADH的为6.22103·cm-1.mol-1,血清量为50l,底物液为1ml,比色杯光径为1cm,则 F=1.05106/6.22 1030.051=3376 返回节

  39. 连续监测法中常数K值的设置 测定酶的判断值或参考范围上限,保证测定的可靠,所 以转氨酶的常数K一般在3000左右,不少人宁愿在1500 左右。 应考虑到测定时间,测定时间短到0.5分,此时0.001嗓 音对每分钟△A误差将是0.002,反之,测定时间延长 到2分钟,误差也小一半。即测定时间长,则K值可以 设置大一些,如测定时间只有0.5分钟,K值一般不超 过4000。 改变K值最方便的途径就是改变标本稀释度,稀释倍数 愈大,K值愈大。 返回节

  40. 连续监测法中常数K值的检验 • 摩尔吸光系数(ε)对一定物质而言常是一个定值,但在一些外界条件影响下也会有所变化。 对硝基酚:当pH>10时,405nm处其ε为18500。 NAD(P)H:当波长大于334nm时,随温度升高,同一波长的ε值会轻度下降。 • ε值在近似单色光的光源条件下才能成立。 • 实际K值的测定。 一些性质稳定的物质如对硝基酚.用高纯试剂配成标准品或直接购买,计算出实际K值。 NAD(P)H反应有关酶测定的K值。葡萄糖终点法测定,产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H。 返回节

  41. 六、临床酶学测定的标准化 • 使用推荐方法和参考方法 • 使用公认的酶校准物或酶参考物 标准化途径 酶活性浓度测定的参考系统 • 建立原级参考方法 • 制备原级参考物 • 建立参考实验室网络 返回节

  42. 第五节 酶的免疫化学测定 酶的免疫化学测定方法  放射免疫测定(RIA)、免疫抑制法、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)、荧光酶免疫测定(FEIA)。 免疫化学法的结果报告方式 (1)用酶活性浓度单位,结果以U/L表示。 (2)用质量浓度单位,结果直接用ng/ml或g/L表示。 血清酶活性与酶质量的变化的关系 注意两者之间的差异,如CK-MB活性与质量不平行。 返回章

  43. 酶的免疫化学测定的优缺点 优点: • 灵敏度高,能测定样品中少量或痕量酶。 • 特异性高,不受体液中其他物质的影响。 • 能测定一些不表现酶活性的酶蛋白; • 特别适用于测定同工酶。 局限性: • 制备足够量的提纯酶和抗血清非常困难且工作量大。 • 测定步骤多,操作繁琐。 • 测定成本高。 返回节

  44. 第六节 同工酶及亚型的测定 一、同工酶的概念及分类 二、同工酶的分析方法 返回章

  45. 一、同工酶的概念及分类 概念: 同工酶是催化相同的化学反应,而酶蛋白的分子结构、 理化性质不同的一组酶。 亚型指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异形成的 多种形式的一类酶。往往在基因编码产物从细胞内释入 血浆时因肽酶作用降解而形成。 分类: 简单分类——原级同工酶和次级同工酶。 基因分类——单基因决定的同工酶、复等位基因同工 酶、多基因决定的同工酶和修饰的同工酶等四类。 返回节

  46. 二、同工酶的分析方法 返回节

  47. 电泳法 电泳材料:醋酸纤维素薄膜、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦及毛细管电泳等。 区带显色:各同工酶区带进行酶促反应显色后,扫描定量,而颜色的深浅与同工酶活性成正比。 巨分子酶产生的原因: 酶与免疫球蛋白形成复合物,如CK-BB-IgG 。 酶与其他蛋白质形成复合物,如LD-β-脂蛋白 。 酶亚基或分子之间形成聚合物,如CK-Mt聚合物、LD亚基自身聚合等。 返回节

  48. 层析法 层析法:利用同工酶分子量大小、所带电荷多少的不 同,以及受某些离子交换剂吸附的强弱程度不同来进 行分离鉴定的方法。 柱层析,如离子交换层析和亲和层析等。因操作方法 费时繁琐,一般不用于临床同工酶常规检测,而主要 用于同工酶的分离、制备、纯化。 返回节

  49. 免疫分析法 免疫抑制法 根据同工酶的某一种亚基与相应的抗体 结合后,酶活性受到抑制,可算出该型同工酶的活性。 如CK-MB活性测定。 免疫沉淀法 该法利用同工酶抗体形成抗原抗体复合 物沉淀的原理,减去法可算出同工酶的活性。 其他免疫学方法测定酶蛋白 利用酶是蛋白类抗原但 含量极微的特点,可应用免疫电泳、RIA、EIA和 CLIA等方法。这类方法的最大特点就是与酶活性无关, 测定酶的质量。 返回节

  50. 动力学分析法 底物特异性分析法 利用不同的同工酶对底物的亲和力 的差异即可进行分析。 抑制剂分析法 利用同工酶之间结构的不同而对同一种 抑制剂有不同的亲和性和反应性来进行分析。 pH分析法 利用不同的同工酶可有不同的最适pH进行分 析。 热失活分析法 利用不同同工酶的耐热性不同来进行分 析与鉴定。 返回节

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