Özel Konakta İnfeksiyon Etkenlerin Saptanması: Viruslar

1. Özel Konakta İnfeksiyon Etkenlerin Saptanması: Viruslar Doç. Dr. Murat Günaydın Ondokuz Mayıs Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji AD.

2. Virolojik Tanı Metotları • Direkt inceleme • İndirekt inceleme • Serolojik yöntemler

3. Direkt İnceleme

4. Viral Antijenlerin Gösterilmesi ile Hızlı Viral Tanı • İmmunfloresan testler • Avantaj • Kısa sürede sonuç (bir kaç saat) • Sorunlar • Duyarlılık hücre kültürüne göre oldukça düşük • Özgüllük daha zayıf • Numune kalitesi önemli • Prosedürler sıkıcı ve zaman alıcı

5. Moleküler Teknikler • Viral genomun gösterilmesine dayalı testlerdir • Duyarlılık ve özgüllükleri çok iyidir • Rutin viroloji laboratuarlarında konvansiyonel metotlara göre hala sınırlı kullanılmaktadır • Bir çok laboratuara moleküler metotlar hızla yerleşmektedir. Viral tanıda her geçen gün önemi artmaktadır

6. Moleküler Teknikler • Klasik moleküler teknikler • Dot-blot, insitu hibiridizasyon ... • Özgüllük hibridizasyon şartlarına bağlı değişir • Duyarlılık konvansiyonel metodlardan daha iyi değil ve pahalı • PCR • Hedef DNA sekanslarının invitro spesifik çoğaltılması • Duyarlılık ve özgüllük çok iyi

7. Diğer Moleküler Teknikler • bDNA duyarlı bir hibridizasyon tekniğidir, linear bir çoğalma sağlar • LCR, NASBA, TMA gibi teknikler signal yada hedef çoğaltma temeline dayanırlar • Duyarlılık klasik teknikler ile PCR arasındadır • Diğer moleküler teknikler amplifikasyonun şekline bağlı olarak değişir • DNA chip teknolojisi’de son dönemde populer olmuştur. Birçok virusu aynı anda araştırmayı, hatta aynı anda ilaç direnç durumunu ortaya koyabilmektedir

8. İndirek inceleme

9. Hücre Kültürü • Klasik hücre kültürü • Sitopatik etki, hemadsorbsiyon • Süre uzun ( 4 hafta) • Numune kalitesine bağlı duyarllık ve özgüllük • Kontaminasyon, yoksik maddelerden etkilenme • Her virus için uygulanamaz • Hızlı hücre kültürü • Shell vial • Kültürde viral antijenlerin 2-4 gün sonra gösterilmesi esasına dayanır • Daha hızlı ve özgül

10. Seroloji

11. Seroloji • Serolojinin yararı, virusa bağlı olarak değişebilir • Respiratuar viruslarda olduğu gibi birçok virus infeksiyonunda, klinik hastalıktan sonra antikorlar ortaya çıkar. • Serolojik tanı genellikle retrospektif olarak konur ve bu nedenle bu tür hastalarda kullanışlı değildir • Akut ve konvelasan dönem serum örneklerinin birlikte değerlendirilmesi için uzun bir süreye ihtiyaç vardır • Benzer viruslarda antijenik çapraz reaksiyon, dolaysıyla yanlış pozitiflik

12. Seroloji’de kriterler • Primer infeksiyon tanısında kriterler • Akut ve konvelasan dönemler arasında IgG veya total Antikor titresinde en az 4 kat artış • Tek ölçümde IgG veya total Antikor titresinin çok yüksek olması- çok güvenli değil • IgM cinsi antikorların gösterilmesi • Serokonversiyon • Reinfeksiyon tanısında kriterler • Akut ve konvelasan dönemler arasında IgG veya total Antikor titresinde en az 4 kat artış • IgM antikorları yoktur yada çok düşük düzeydedir

13. Akut infeksiyondan sonra tipik profil Reinfeksiyon esnasında IgM ya yoktur ya da çok düşük seviyelerdedir

14. Viral infeksiyonlar • Organ transplantasyonlarından sonra ve immun supresyon durumlarında viral infeksiyonlar fırsatçı ajanlar olarak karşımıza daha sık çıkar • Selim seyreden viral infeksiyonların çoğu daha ağır ve ölümcül seyreder

15. Viral İnfeksiyon Transplantasyon sonrası • İlk ay • Nozokomiyal infeksiyon • 1-6 ay • Fırsatçı infeksiyonlar • > 6 ay • Toplumdan kazanılmış infeksiyonlar

16. HSV EBV,Adenovirus, Papovavirus, Parvovirus Anti rejeksiyon tedavi ile birlikte CMV başlangıç CMV VZV 1 yıl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Transplantasyon Aylar Viral İnfeksiyonlar

17. Viral infeksiyonlar • Bir çok viral etken için kullanılabilecek ajan mevcuttur. • Toksik etkileri nedeni ile doğru kullanımları gereklidir • Hastalığın çıkışını önleme • Hastalığın gidişini kontrol • Hızlı ve doğru tanı yöntemleri • Özellikle solunum yolu infeksiyonlarında • Gereksiz antibiyotik kullanımı

18. Viral infeksiyonlar • Özel viral infeksiyonlar • En önemli infeksiyon etkeni • Cytomegalovirus • Transplantasyon olgularının 2/3’ünde etken • 1-4 ayda sık • İmmunosupresif tedavi • Son dönemde önem kazanan ajanlar • Solunum yolunun viral patojenleri

19. CMV • Transplant hastalarında ve immun yetmezliği olanlarda ciddi hastalıklara ve ölümlere neden olabilmektedir • CMV infeksiyonu • Semptom olmaksızın örneklerden virusun bulunması • CMV hastalığı • İnfeksiyon ile birlikte semptomların eşlik etmesidir

20. CMV tanı yöntemleri • Histoloji ve sitoloji • Hücre kültürleri • Konvansiyonel • Hızlı hücre kültürleri • Antijenemi testleri • Nükleik asit göstermeye dayalı teknikler • PCR ve Hibridizasyon yöntemleri • mRNA saptama yöntemleri • NASBA (nucleic asid sequence-based amplification) • Seroloji

21. CMV Hücre Kültürü • Konvansiyonel hücre kültürü • CPE geç oluşur • Kullanım için uygun değildir • Direnç için kullanılabilir • Hızlı hücre kültürü • Monoklonal antikorlarla viral antijenlerin 24-48 saat içinde gösterilir • Buffy coat daha erken pozitifleşir • İdrar ve orofaringeal örneklere göre daha değerlidir

22. CMV Hücre Kültürü • Hızlı kültür tekniği • Belirli sayıda lökosit inokülasyonu • Kantitatif sonuç • Antiviral yanıt izlenebilir • Lökositler hücrelere toksik etkili • Duyarlılığını azaltmaktadır • 24-48 saat içinde viremide belirgin azalma • CMV antiviral ajana duyarlı • 48 saatten sonra viremi devam ediyor • CMV antiviral ajana dirençli?

23. CMV IFA • A: Hücre kültürlerinde exprese edilmiş CMV antijenleri hızlı immunflorosan boyama teknikleri ile monokonal Ab kullanılarak gösterilebilir (insan fibroblasts hücrelerinin çekirdeklerinde, CMV early antijen) • B:Buffy coat kullanılarak fibroblastlar CMV ile infekte edilmiş (CMV early antijenine karşı oluşmuş monoklonal antikor ile direkt boyanmmıştır.

24. CMV Antijenemi testi • Periferik kan lökositlerinde antijen pozitifliği • Aktif CMV infeksiyonu • Antijenemi düzeyine göre preempitif tedaviye başlamaya karar verilebilir • <50/2*105 düzeyi • Asemptomatik infeksiyon • Antijenemi düzeyi izlenmelidir • 100/2*105 düzeyi • Semptom aranmaksızın tedaviye başlanır. • Direnç yoksa • Antijenemi testi tedavi sonrasında negatifleşir. • Tedavinin ilk haftasında antijen düzeyi artabilir • Direnç olarak değerlendirilmemelidir

25. CMV Antijenemi testi • Belli sayıda lökosit içersinde antijen pozitif hücrelerin sayımı • Viral yük kantitatif olarak saptanabilir • Antijenemi saptayan yöntemler • Hücre kültüründen daha duyarlıdır, • Hastalık bulguları ortaya çıkmadan kültürden 7-14 gün daha önce saptanabilmektedir • PCR’a yakın bir duyarlılığa sahiptir • Lökositlerin düşük olduğu durumlarda PCR tercih edilir

26. CMV Antijenemisinin Gösterilmesi • Nötrofillerdeki CMV pp65 matrix proteinini gösterme • Kahverengi olarak peroksidaz ile boyanmış • Bu antikorlarla boyanmış Pozitif hücre sayısı infeksiyonun şiddeti ile doğru orantılı

27. CMV Nükleik Asit Hibridizasyon • Kantitatif sonuç verilebilir • Hibrid yakalama CMV DNA testi (700 kopya/ml) • bDNA sinyal amplifikasyon testi (900/106 lökosit) • Viral yükün düşük olduğu durumlarda izlem için uygun değildir, • bDNA’nın kullanımı lökopenik olgularda sınırlıdır

28. CMV: Kalitatif PCR • CMV PCR pozitifliği akut infeksiyonu gösterir • Lökosit, serum ve plazma örneklerinde • Kalitatif ve kantitatif çalışılabilir • Kalitatif PCR  negatif • Seronegatif ve seropozitif hastlarda CMV negatif • Kalitatif PCR  pozitif • Seronegatif olgularda CMV infeksiyonu • Yüksek duyarlılık • Kalitatif çalışmalarda seropozitif hastalarda latent virusun saptanmasına neden olabilir

29. CMV: Kantitatif PCR • Latent/aktif infeksiyon ayırımında • Tedavinin izlenmesinde • Periyodik testlerde viral yükün artması tedavi endikasyonu kabul edilir • Tedavi bitiminde testler negatifleşmeli veya viral yük belirgin oranda azalmalıdır • Aksi dirence işaret eder • Ticari, kantitatif, standardize • Cobas amplicor CMV monitor testi • Duyarlılığı >400 kopya /ml • Yeni, kullanışlı, hızlı testler • Real-time PCR

30. CMV: mRNA saptama • CMV’nin yapısal proteinlerini kodlayan genler • Aktif infeksiyon sırasında transkripte edilir • Spesifik mRNA dizilerinin saptanması aktif infeksiyonu gösterir • IE-mRNA, E-mRNA, L-mRNA • Buna yönelik RT-PCR ve NA sekans esaslı amplifikasyon testleri yapılabilir (NASBA) • Ticari olarak mevcut olan bu test de standardizedir • Kalitatif olarak sonuç verir, ancak geç proteinlerden biri olan pp67 mRNA dizilerinin araştırılması hem aktif CMV’yi göstermede hem de tedaviye yanıtı takipte denenebilir

31. CMV: Seroloji • Transplant hastaları için uygun değildir • Serolojik testler aktif infeksiyonu göstermede yetersiz kalır • IgG antikorları geçirilmiş infeksiyonu gösterir • IgM akut infeksiyonu göstermesi beklenir, • Ancak değişik zamanlarda da pozitif saptanabilir • Çapraz reaksiyonlar tanıyı karıştırabilir • Avidite testleri denenebilir

32. CMV: Flow Sitometri • CMV antijenleri çok erken ve duyarlı olarak bu yöntemle saptanabilir • CMV DNA floresan insitu hibridizasyon tekniğine uyarlanarak duyarlılık artırılabilir • CMV’e karşı oluşmuş spesifik sitotoksik T lenfositler saptanabilir ve tanıya farklı bir boyut getirebilir

33. CMV Sonuç • Yeni gelişen teknikler • Doğru ve zamanında tedavi • Mortalite de düşme • Transplant sonrası • CMV’nin en sık görüldüğü ilk 4 ayda • Kantitatif sonuç veren testlerden biriyle haftada 1 izlenmelidir. • İki farklı testin kullanımı maliyet göz ardı edilirse duyarlılığı artırabilir

34. Solunum Yolu Viral Ajanları • İmmunkomprimise hastaların solunum yolu infeksiyonlarında viral ajanlar özellikle son dekadda dikkat çekmektedir • Viral infeksiyonlarla birlikte ölüm riski artmaktadır • Toplumdan kazanılmış yada nozokomiyal pnömonilerde • RSV • İnfluenza virus, • parainfluenza virus • Adenovirus • Picornaviruslar

35. Hücre kültürü • Hücre kültürü altın standart dır • Hızlı tanı için uygun değil (2-10 gün) • Klinik değeri sınırlı • Hep-2C, R-HELA, t-MK • Kültürlerde haftada 2 kez sitopatik etki gözlenir • Pozitif kültürlerde, immunfloresan testlerle monoklonal antikorlar kullanılarak tanımlama yapılır

36. RSV Hücre Kültürü • Hep-2 hücre kültüründe RSV’ye bağlısitopatik etki. • Sinsutyum oluşumu • İmmunperoksidaz metotla boyanmış

37. Viral Antijeni gösterme • İmmunfloresan testler • Bir kaç saat içersinde sonuç alınabilir • Hücre kültürüne göre duyarlık düşüktür • Özgüllük her zaman yeterli olmaz • Her virus için kit bulunmayabilir

38. RSV IFA • Nasal yıkama suyu RSV’e karşı oluşmuş bovine antikorla boyanmıştır • İnfekte mononükleer hücrelerin sitoplazmasında görülen yeşil boyanma pozitifliği gösterir

39. PCR • Duyarlı ve özgül • Single veya multiplex PCR • Nested RT-PCR • RSV • Parainfluenza virus 1-3 • Influenza virus A ve B • Rhinovirusler • Enteroviruslar • Coronaviruslar

40. PCR • Influenza A ve B • (A:matrix protein, B:hemaglütinin geni) • Parainfluenza 1-3 • (hemaglutinin nöraminadaz glikoproteini) • Picornaviruslar (Rhino ve enteroviruslar) • (5’ nonkoding bölge) • RSV A ve B • (nukleokapsid proteini) • Coronavirus • (nukleokapsid proteini)

41. PCR • BAL’ın üst solunum yolu florası ile kontaminasyonu • Bu tür hastalar uzun süre virus salarlar • Hızlı ve duyarlı yöntemlere ihtiyaç vardır • Moleküler yöntemler klasik yöntemlere göre solunum yolu virus tayin hızı ve oranını büyük ölçüde artırmıştır • Sonuçların klinik değeri? • Daha fazla çalışmalara ihtiyaç vardır

42. Seroloji • Çift serum örneği ile yapılacak çalışmalarda titrede en az 4 kat artış aranır • Kompleman fiksasyon testi • RSV, influenza A ve B, Parainfluenza 1-3, Adenovirus • İndirekt immun floresan • RSV, Influenza A ve B

43. Solunum Yolu örnekleri • Bronkoalveolar lavaj (BAL), Burun Boğaz sürüntüsü • Viral transport mediuma, • En kısa sürede laboratura gönderilir, maksimum 24 saat +4oC’de bekletilebilir • Laboratuvara gelen materyalin Materyalin bir kısmı viral kültür ve/veya antijen çalışmaları için kullanılır • Kalan kısmı –70oCde saklamaya alınır, • Çift serum örneği alınır

44. EBV Tanı • Monospot testi • % 10-15 negatif • VCA-IgG • Akut, geçirilmiş • VCA-IgM • Primer EBV infeksiyonu (1-2 ay pozitif) • EA karşı Ab • Akut infeksiyon • NA karşı Ab • Geçirilmiş infeksiyon

45. VZV: Tanı • Transplant öncesi seroloji bilinmeli • Hücre kültürü • Tzank preparat • Hibridizasyon • PCR

46. HSV • Biopsi • Direkt immunofloresan • Tzank testi • Kültür • Seroloji • Primer infeksiyon tanısında yardımcı