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Presentation Transcript

  1. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Protocole d’étude du potentiel chondroprotecteur des eaux minérales in vitro Jean Cambar, Béatrice L’Azou, Christian Toussaint, Céline Ohayon Faculté de Pharmacie – EA 3672 Université Victor Segalen - Bordeaux 2, France

  2. Le contexte : le thermalisme et l’arthrose • Orientation Rhumatologie : 135 000 curistes (30% de la fréquentation) • Arthrose : 81 000 curistes (60% des curistes en RH) • Avantages du thermalisme • Baisse de la douleur • Diminution de la consommation de médicaments • Traitement non agressif • Mécanismes d’action ? • Techniques thermales, prise en charge globale du patient.. • Propriétés physiques et/ou chimiques des produits thermaux 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  3. La démarche générale de notre équipe • Hypothèse : certains éléments minéraux connus pour leur tropisme pour les os et le cartilage, auraient des propriétés anti-arthrosiques. • Approches envisagées • Étude du passage transcutané des éléments contenus dans l’eau minérale et la boue thermale (cuivre, zinc, strontium, manganèse …) • Recherche de l’activité in vitro de ces éléments sur des modèles cellulaires pertinents 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  4. Passage transcutané • Le passage transcutané d’éléments des eaux minérales a déjà été mis indirectement en évidence • Par traceurs radioactifs (Dubarry, Tamarelle, 1971 - 1972) • Par mesure des niveaux sériques (Sukenik, 1992) • Protocole de nos études antérieures • Cellule de diffusion (Franz) sur peau humaine avec compartiment de recueil contenant du plasma humain • Modalités expérimentales proches des pratiques thermales (applications répétées de boue ou d’eau) • Dosage spectrométrique des éléments dans le plasma de recueil • Aucun passage : fer, sodium, potassium, chlorure, calcium • Passage : manganèse, strontium, zinc et cuivre 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  5. Arthrose et modèles cellulaires in vitro • Mécanismes de l’arthrose encore mal connus • Principalement lié à un dysfonctionnement de la cellule constitutive du cartilage, le chondrocyte • Déséquilibre entre les phénomènes d’anabolisme et de catabolisme du cartilage articulaire : le chondrocyte est anormalement stimulé et dysrégulé. • L’utilisation de cultures cellulaires de chondrocytes représente un modèle d’étude pour mettre en évidence les modifications métaboliques survenant dans le cartilage. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  6. Intérêt des modèles in vitro • Contributions reconnues et déjà validées des modèles in vitro en pathologie et en thérapeutique. • Déjà des références en thermalisme avec des modèles de fibroblastes, de cellules musculaires,.. • Corrélations avec les études sériques de marqueurs de l’inflammation chez des patients arthrosiques; 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  7. Présentation du projet • Choix des éléments à tester : Sr et Mn • Choix du modèle cellulaire : chondrocytes humains sains en primoculture • Objectifs • Valider le modèle cellulaire (amplification et différentiation) • Déterminer la viabilité et la prolifération cellulaires en présence de Sr et de Mn (pour définir les doses et la durée d’exposition) • Caractériser certains marqueurs de la matrice extracellulaire • Mesurer l’effet du Sr et Mn sur la balance synthèse/dégradation des constituants de la MEC • Étude retenue par l’AFRETH pour un financement d’une durée de 1 an 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  8. Choix des éléments • Le strontium • cation bivalent avec une forte affinité pour l’os, • effet bénéfique, soit sur la production de la MEC (stimule la production de protéoglycannes), soit par inhibition de la dégradation du cartilage dans l’arthrose, • Le manganèse • rôle dans la constitution d’enzymes et de métalloenzymes, • optimise la production des glycosaminoglycannes et donc des protéoglycannes, • Vérifier l’action du strontium, du manganèse et de leur association sur cultures de chondrocytes humains 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  9. Choix du modèle cellulaire • Primoculture de cellules cartilagineuses humaines saines • Disponibles dans le commerce • Garanties pour • Conservation du phénotype si ≤ 10° doublement de population • Production de collagène II 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  10. Objectif 1 : validation du modèle de culture • Difficultés : • maintenir les chondrocytes dans un état différencié stable • tout en permettant la multiplication des cellules • Plusieurs modèles de cultures testés • Choix de primo-cultures de chondrocytes de veau 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  11. Laminine Collagène I Ac Coll. I Choix du modèle • Matériel facilement disponible : primocultures de chondrocytes de veau (A.M. Freyria, ibcp, Lyon) • 1° approche : culture organotypique, culture sur biomatériaux ou sur gel, culture en suspension • Maintien du phénotype • Faible production de cellules • Méthodes complexes • Incompatibles avec les tests réalisés • 2° approche : culture en monocouche sur des surfaces spécifiques (laminine, collagène I) • Multiplication des cellules • Méthodes plus simples • Phénotype instable Agarose 2% 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  12. Choix du modèle • 3° approche : culture en monocouche sur plastique • Méthodes plus simples,compatibles avec nos études • Augmentation du pouvoir prolifératif • Phénotype variable selon l’origine des cellules (espèces, âge) et la densité cellulaire • Approche retenue : culture en forte densité, en vérifiant le phénotype(méthodes immunochimiques et de biologie moléculaire) Faible densité Forte densité 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  13. Objectif 2 : études de la viabilité • Permettent de déterminer les doses de Sr et Mn non toxiques à utiliser et de quantifier un éventuel pouvoir prolifératif. • Phase préliminaire sur lignée de cellules mésangiales humaines (IP15) • Matériel cellulaire disponible au laboratoire en grande quantité (lignée stable) • Matériel humain produisant de la matrice extracellulaire • Phase de confirmation sur chondrocytes de veau 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  14. Résultats de viabilité cellulaire (IP15) • Méthodologie : • Utilisation d’un colorant vital (rouge neutre) • Mesure de l’intégrité membranaire (lysosomes) • Évaluation du nombre de cellules vivantes 24 h 72 h 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  15. Résultats de la prolifération cellulaire (IP15) • Méthodologie : • Utilisation d’un colorant vital (rouge neutre) • Mesure de l’intégrité membranaire (lysosomes) • Évaluation du nombre de cellules vivantes en fonction du temps 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  16. Confirmation des résultats sur chondrocytes • Le Sr et le Mn n’induisent aucune mort cellulaire, ni prolifération cellulaire, quelle que soit la dose utilisée. 72 h • Choix des doses de l’étude • Sr : 0,01 - 0,1 et 1 mg/ml • Mn : 1 - 10 et 100 µg/l • Choix de la durée d’exposition • 72 h, 7 j et 21 j Compatibles avec les résultats des études du passage transcutané et les pratiques thermales 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  17. Objectif 3 : marqueurs de la MEC • Mise en évidence et quantification des constituants majoritaires de la MEC synthétisés par les chondrocytes (libérés dans le surnageant et/ou ancrés sur les cellules) • Collagènes • méthode biochimique colorimétrique (rouge de Sirius, kit Biocolor, Sircol™) • quantification de tous les collagènes solubles • Protéoglycannes • méthode biochimique colorimétrique (bleu de méthylène, kit Biocolor, Blyscan™) • quantification des glycosaminoglycannes sulfatés 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  18. Résultats de l’étude des marqueurs de la MEC • Niveau basal des GAGs (veau et homme) • Niveau basal Collagène • Niveau basal très élevé (biais méthodologique, présence de collagène dans le milieu de culture) • Nécessité de mettre en œuvre la RT-PCR pour utiliser ce marqueur 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  19. Objectif 4 : effet du Sr et Mn sur la MEC • Cellules de chondrocytes de veau • Pas de modification du niveau basal Pas d’action cellulaire directe sur les marqueurs choisis Envisager d’autres marqueurs comme les cytokines pro-inflammatoires (MMP, TIMPs) et les IL. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  20. Effet du Sr et Mn en présence d’IL-1 • Nécessité de mettre en œuvre une autre approche : effet potentiel de restauration en présence d’agents catabolisants (IL-1) pour mimer les chondrocytes arthrosiques. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains

  21. Conclusion • Cette étude réalisée in vitro sur chondrocytes permet • de disposer d’un modèle d’étude rapide de l’effet des éléments minéraux contenus dans les produits thermaux, • d'étudier l’effet de ces éléments sur la production des constituants majoritaires de la matrice extracellulaire, • d’évaluer leur effet sur la balance synthèse/dégradation de la MEC • Mais, il sera nécessaire de mettre en œuvre des moyens supplémentaires (de biologie moléculaire, d’immuno-histochimie et biochimiques) pour approfondir les mécanismes impliqués. 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains