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基因工程原理

基因工程原理. Principles of Gene Engineering. 湖北中医药大学检验学院 生物技术教研室.

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基因工程原理

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Presentation Transcript

  1. 基因工程原理 Principles of Gene Engineering 湖北中医药大学检验学院 生物技术教研室

  2. 课程初步安排：理论48学时章节内容 学时第一章 绪 论 2第二章 分子克隆工具酶 9第三章 分子克隆载体 4第四章 　 人工染色体载体 5第五章 　 表达载体 5第六章 　 基因操作中大分子的分离和分析 5第七章 基因芯片技术 1第八章 　 PCR技术及其应用 4第九章 　 DNA序列分析 3第十章　　DNA诱变　 　　　　　　 4第十一章　DNA文库的构建和目的基因的筛选 6

  3. 第七章 基因芯片技术

  4. 基因组学研究的成果

  5. 植物的生长周期和环境与基因表达 生长周期: 苗期、分蘖期、抽穗期、灌浆期等 环 境 ： 土壤、重力、光照、温度、湿度等 营 养 ： N、P、K、微量元素等 生物胁迫： 细菌、真菌、病毒、虫等 非生物胁迫：干旱、盐碱、重金属等

  6. 1. 基因芯片 • 基因芯片的定义 • 基因芯片分析流程 • 基因芯片技术的发展史 • 基因芯片技术的特点

  7. 生物芯片技术的定义 通过平面微加工技术在固体芯片表面构建微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。

  8. 生物芯片技术的历史 • 1989年英国科学家Southern申请了有关在固体表面进行DNA杂交的专利。这是有关基因芯片的第一个专利 • 1992年世界上第一块原位合成基因芯片在美国Affymetrix公司诞生 • 1995年世界上第一块微矩阵基因芯片在美国斯坦福大学实验室诞生 • 1997年世界上第一张全基因组芯片——酵母芯片完成(斯坦福大学Brown实验室)。它含有6116个基因

  9. 高通量—提高信息量 平行化—提高信息的可比性 微型化 微量化—降低待检样品用量 自动化—提高工作效率 低成本—可迅速普及推广 生物芯片的特征与优点

  10. 2. 基因芯片的分类 • 根据分析对象可分为： • 细胞固定技术 • DNA芯片技术 • 蛋白质芯片技术 • 根据芯片制作材料及方法可分为： • Array • Microarray • DNA chip • Lab on a chip

  11. Array • 用尼龙膜作固体支撑表面，将目标基因 • DNA排列在膜的表面并固定 • 杂交方法与常规Southern杂交相同。即 • mRNA反转录32P或33P标记的cDNA作探针进 • 行杂交 • 这种方法经典，稳定，但密度低， • 8×12cm的膜可点4×384=1536个基因

  12. Microarray • 用经特殊处理的玻璃片（载玻片）作固体支持表面，将目标基因DNA排列在玻片表面并固定。 • 探针采用多色荧光标记。 • 其特点是，密度高、制作方便，是目前应用最广泛的基因芯片之一

  13. DNA chip（Affymetrix公司) • 在玻璃或朔料表面经光化学处理，运用固相合成技术在固体表面直接合成各种不同的寡聚核苷酸（一般为20bp）。 • 探针采用多色荧光标记。 • 其特点是，密度可高达10万个基因/芯片

  14. Lab on a chip • 运用集成电路控制电极，使电极与目标DNA分子结合 • 与探针杂交 • 自动化程度高，具有极高的发展前景 Nanogen公司

  15. 3.基因芯片技术的理论基础 • 以Microarray为例，基因芯片技术包括下面几个方面的问题 • DNA分子在刚性表面的固定 • 探针的标记 • 杂交

  16. Si-OH +Cl-Si-(CH2 )n-NH2 Si-O-Si-(CH2 )n-NH2 Si-O-Si-(CH2 )n-NH2 + C Si-O-Si-(CH2 )n-N O C CH2－C CH2－C －NH2 + O N－ CH2－C CH2－C DNA分子在刚性表面的固定 • 在玻璃片表面存在大量的Si-OH ,表面氨基化处理: • 氨基化表面与核酸的结合 • 未反应氨基的封闭

  17. 探针的标记 • 标记底物－dUTP 替代物Cy3、Cy5掺入cDNA合成 Cy5-AP3-dUTP: Ex. 649nm Em. 670nm Cy3-AP3-dUTP: Ex. 550nm Em. 570nm

  18. 影响杂交的因素 • 核酸分子的结构和组成 • GC含量 G C A T • 杂交液的组成和离子强度 • 水溶液、甲酰胺水溶液 • 杂交温度

  19. 4.基因芯片的制作 • 结合我们实验室的工作介绍Microarray芯片的制作 • 基因的分析与选择 • cDNA文库的构建 • cDNA的测序及Bioinformatics分析 • 目标cDNA的扩增 • 点样 • 固定

  20. 明恢６３平衡化cDNA 文库:材料 • 愈伤组织 • 苗期组织 • 三叶期 • 五叶期 • 黄化苗 • 茎 • 分蘖期 • 花期 • 根 • 剑叶 • 低氮胁迫 • 穗 • 第0~3期幼穗 • 花期 • 灌浆期 • 完整植株 • 穗分化：一级枝梗分化、二级枝梗分化 • 抽穗期 • 白叶枯菌种Pxo61胁迫 • 稻瘟病菌胁迫 • 干旱胁迫 • 低磷胁迫

  21. cDNA 序列分析 • 明恢６３平衡化cDNA 文库 62,000 克隆 平均插入片段大小 1.2 kb • 序列分析 已测序35,760 克隆 收集水稻EST序列147,191条（公用数据库中） 应用生物信息学的方法分析得到单一序列的基因克隆11,566个

  22. 载玻片处理 • 2MNaOH, 70%ethanol,2hr • Rinse with distilled water • poly-L-lysine adhesive solution for 1hr • Dry in vacuum oven

  23. Arrayer

  24. SOLID PIN Genomic Solutions BioRobotics Genmachine • 结构简单 • 样品用量少 • 易清洗 • 点样量与液面高度有关 • 点样速度慢结构简单 • Spot size:80-150 µm

  25. QUILL BioRobtics Cartesians Genemachin • 一次取样可点多点 • 点样速度快 • 样品用量少 • 难清洗 • 点样精度差 • Spot size:80-200 µm

  26. JET Molecular Dynamics Cartesians • 点样速度快 • 点样体积可控制 • 浪费样品 • 难清洗 • Spot size:200 µm

  27. Solid Pin with Ring Genetic MicroSystems • 点样速度快 • 斑点均匀 • 容易清洗 • 样品浪费 • Spot size:150 µm

  28. DNA在玻片上的固定 • 老化 DNA与玻片结合 • 保湿 更多DNA与玻片结合 • 保温 更多DNA与玻片结合 • 交联 DNA 与H2N-Lys结合 • 封闭 封闭玻片表面H2N-Lys • 清洗 除去杂质

  29. 基因芯片的杂交及结果分析 • 实验设计 • 实验目的 • 实验材料 胁迫条件（时间、空间） • RNA提取 • mRNA的标记及杂交 • 结果及分析 • 扫描结果 —原始数据的获得 • 分析 — 分析软件 Imagene 4.2、Genepix etc. • 根据分析结果，找出与实验目标相关的基因

  30. 杂种一代与亲本基因表达谱分析 • 实验材料： • 杂种一代：金23×明恢63 • 亲本: 金23，明恢63 • 取杂种一代和亲本穗分化第四期幼穗总RNA，等量混合亲本总RNA • 杂种一代中差异表达基因数目: • 上升表达: 152 下降表达: 39 • 差异表达基因功能： • 42个与功能已知的基因同源，包括：11种代谢酶类，5种载体蛋白，4种激酶和2种蛋白酶抑制剂等，其它149个基因的功能未知。

  31. 水稻低氮胁迫诱导基因表达谱分析 • 实验材料 • 明恢63幼苗 • 处理方法 • 1/6正常氮浓度营养液 • 正常氮浓度营养液 • 差异表达基因数目 • 上升表达: 111 下降表达: 71 • 差异表达基因功能： • 上升表达基因包括可能的调控蛋白和转运蛋白 （真核生物翻译起始因子2 β 亚基，假想内在膜 蛋白等）代谢酶（乙醛氧化酶，茶儿酮合成酶等） 等以及其它功能未知基因.

  32. 水稻低磷胁迫诱导基因表达谱分析 • 实验材料 • 水稻品种Lagrue 细胞悬浮培养物 • 处理方法： • 低浓度磷营养液（0.114mM/ml）培养 • 正常浓度磷营养液 (0.777mM/ml)培养 • 差异表达基因数目 • 上升表达: 67 下降表达: 46 • 差异表达基因功能 • 大约2/3上升表达基因与已知功能基因同源，例如：磷酸丙糖异构酶，磷酸甘油酯变位酶，丙酮酸激酶，乙醇脱氢酶，丙酮酸脱氢酶等。

  33. 水稻干旱胁迫诱导基因表达谱分析 • 实验材料 • 旱稻: ITATA 109 (耐干旱) • 水稻: Zhenshan 97 (干旱敏感) • 处理方法 • 两组材料断水处理 • 两组材料正常供水 • 差异表达基因数目 • ITATA 109: 147 (上升) 25 (下降) • Zhenshan 97: 48 (上升) 23 (下降) • 差异表达基因的功能 • 大约三分之一的上升表达基因与已报道的干旱诱导表达基因高度相似，例如：类疏水蛋白，类酸性磷酸酶蛋白，叶绿素a/b结合蛋白，过氧化物异构酶，细胞质3-磷酸甘油醛脱氢酶 gapc 4, 超氧化物岐化酶，假想myb相关蛋白等.

  34. 干旱胁迫 对照 旱稻ITAT 109幼苗干旱胁迫基因表达谱（5760 条非重复cDNA克隆）

  35. DNA芯片的应用 • RNA 表达分析 • 比较基因组分析 • 单核苷酸多态性（SNP）分析 • 临床检验

  36. 临床应用领域 病原体基因组检测 —— RNA病毒、DNA病毒、细菌、 支原体、衣原体、寄生虫、抗药性质粒、…... 遗传性疾病基因组检测 ——血型基因组、各种遗传 性疾病产前诊断 ——肿瘤、个体差异等 病理状况下基因表达特征分析

  37. 研发中的遗传病诊断芯片 • 地中海贫血分类芯片 • 唐氏综合征产前诊断芯片 • HLA分型芯片 • Rh 血型检测芯片 • …….

  38. 研发中的病原体检测芯片 肝炎诊断芯片系列 用于肝炎的诊断与鉴别诊断 血检芯片系列 用于检测血制品中的乙肝、丙肝、梅毒、爱滋病 商检芯片系列 用于检测进口动植物的基因型、病原体，以及是 否是转基因品种等

  39. THANKS！

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