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Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular

1065. Inmunología Aplicada Enseñanza Experimental. Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular. Material. 1 estuche de disección 6 agujas hipodérmicas 2 vasos de precipitado de 150 mL 1 tubo de cultivo estéril de 15 mL 1 micropipeta (200-1000 m L) 1 micropipeta (20-200 m L)

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Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular

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Presentation Transcript

  1. 1065. Inmunología AplicadaEnseñanza Experimental Estimulación de Linfocitos y Cultivo Celular

  2. Material • 1 estuche de disección • 6 agujas hipodérmicas • 2 vasos de precipitado de 150 mL • 1 tubo de cultivo estéril de 15 mL • 1 micropipeta (200-1000 mL) • 1 micropipeta (20-200 mL) • 1 micropipeta (2-20 mL) • Puntas para micropipetas estériles • 1 piseta • 1 gradilla • 1 tubo para microcentrífuga estéril • 1 microplaca para cultivo con 24 pozos • 1 cámara de Neubauer

  3. Material • 1 jeringa estéril de 5 mL • 1 caja Petri estéril • 3 pipetas estériles de 5 mL • 2 tubos de 13x100 estériles con tapón de gasa • 10 gasas estériles NOTA. Material por equipo.

  4. Reactivos • Medio RPMI sin suplementar • Medio RPMI suplementado (piruvato, estreptomicina/penicilina, suero fetal bovino, aminoácidos no esenciales, glutamina) • Etanol al 70% • Azul tripano al 0.04% • Concanavalina A en concentración óptima • Éter etílico

  5. Material biológico • 1 ratón de la cepa BALB/c de 25 días de edad

  6. Anestesiar al ratón en una cámara con éter Obtener el bazo quirúrgicamente y colocarlo en la caja Petri Perfundir gota a gota con 5 mL de medio RPMI no suplementado Resuspender el botón celular en 5 mL de RPMI suplementado Centrifugar a 1500 rpm durante 10 minutos (lavar 2 veces en las mismas condiciones) Transferir la suspensión celular al tubo de 15 mL con tapón Obtención de células esplénicas

  7. Realizar una dilución 1:20 de la suspensión de linfocitos con azul tripano en un tubo para microcentrífuga Tomar 10 mL de la dilución anterior y llenar la cámara de Neubauer Realizar el conteo de linfocitos viables en el microscopio a un aumento de 40X Ajustar la suspensión de linfocitos con RPMI suplementado a 106 cel/mL Cuenta de linfocitos

  8. LINFOCITOS ESTIMULADOS LINFOCITOS CONTROL Llenar 3 pozos con 500 mL de la suspensión de linfocitos ajustada Llenar 3 pozos con 500 mL de la suspensión de linfocitos ajustada Adicionar 500 mL de Concanavalina-A 2.5 mg/mL Adicionar 500 mL de RPMI suplementado Incubar la microplaca a 37°C con atmósfera de CO2 al 5% durante 24 h Revisar el cultivo en un microscopio invertido con contraste de fases Cultivo celular

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