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生化生产 工艺学

生化生产 工艺学. 第二章 工业微生物基础. 微生物 在生化生产过程中起着重要作用，它是决定生化产品是否具有产业化价值和商业化价值的关键因素，也是生化生产过程的灵魂和核心。. 培养基配制. 空气除菌. 发酵设备. 种子 扩大培养. 培养基灭菌. 发酵生产. 下游处理. 微生物 工业生产的一般流程. 内容提要. 微生物的特点 常见的工业微生物 工业微生物菌种的分离、选育和改良 工业微生物菌种的保藏 工业微生物菌种的扩大培养 已工业化产品生产菌的介绍. 1. 微生物的特点

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生化生产 工艺学

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  1. 生化生产工艺学 第二章 工业微生物基础

  2. 微生物在生化生产过程中起着重要作用，它是决定生化产品是否具有产业化价值和商业化价值的关键因素，也是生化生产过程的灵魂和核心。微生物在生化生产过程中起着重要作用，它是决定生化产品是否具有产业化价值和商业化价值的关键因素，也是生化生产过程的灵魂和核心。

  3. 培养基配制 空气除菌 发酵设备 种子扩大培养 培养基灭菌 发酵生产 下游处理 微生物工业生产的一般流程

  4. 内容提要 • 微生物的特点 • 常见的工业微生物 • 工业微生物菌种的分离、选育和改良 • 工业微生物菌种的保藏 • 工业微生物菌种的扩大培养 • 已工业化产品生产菌的介绍

  5. 1. 微生物的特点 微生物是指那些个体微小，结构简单，必须借助显微镜的帮助才能看清它们外形的一群微小生物。 1、种类多，分布广 2、高面积-体积比，代谢能力强 3、生长迅速，繁殖快 4、适应性强，容易培养 5、易变性

  6. 2. 常见的工业微生物 • 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。 • 在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、放线菌生长的噬菌体。 • 发酵工业上常用的微生物主要有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。

  7. 2. 常见的工业微生物 • 细菌 属原核单细胞生物，有球菌、杆菌和螺旋菌、丝状菌四类，分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌，它易形成芽孢。 芽孢：某些细菌在其生长发育后期，可在细胞内 形成一个圆形或椭圆形的抗逆性休眠体。抗热、抗辐射、抗化学物质。如热解糖梭菌的营养细胞在50度下经短时间即被杀死，而它的一群芽孢在132度下经4分多钟才能杀死其中的50%。

  8. 细菌工业上大量用于生产氨基酸、核苷酸、酶、多糖、和有机酸。细菌工业上大量用于生产氨基酸、核苷酸、酶、多糖、和有机酸。 • 工业上常用的细菌：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌和谷氨酸棒状杆菌。

  9. 大肠杆菌 应用：生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。

  10. 嗜酸性，最适pH5.5～6.0,pH3.0～4.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌的繁殖，乳酶生即由活的乳酸杆菌制成，可治疗消化及腹泻。酸牛奶中的乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌的作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确的相互关系。 乳酸杆菌 应用：乳酸、干酪、奶酒、发面、泡菜、酸奶等的制作

  11. 单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。 • 枯草芽孢杆菌 • 应用：生产淀粉酶

  12. 2. 常见的工业微生物 B. 放线菌 属原核生物，菌落呈放射状，广泛存在于泥土中，最大经济价值是用来生产抗生素。 根据菌丝形态和功能 可以分为营养菌丝、 气生菌丝和孢子菌丝。 繁殖方式： 以无性孢子的方式 进行繁殖

  13. 种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌 • 应用：各类抗生素。如土霉素、四环素、链霉素、红霉素。

  14. 2. 常见的工业微生物 C. 霉菌 属真核生物，俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工业原料、产品和农副产品的发霉变质。 霉菌菌丝根据构成和功能不同可分为营养菌丝、无隔菌丝和有隔菌丝。

  15. 应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶

  16. 应用：酱油、酱类（淀粉酶）

  17. 米曲霉 • 应用：产糖化酶和蛋白酶、主要用于酿酒制曲和酱油制曲

  18. 毛 霉 • 应用：可以产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等的制作

  19. 应用：生产丁二酸、土霉素

  20. 根霉 • 种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉 • 应用：酿酒上用它作淀粉质原料酿酒的糖化菌。

  21. 青霉菌

  22. 青霉菌

  23. 青霉菌 应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶

  24. 2. 常见的工业微生物 D. 酵母菌 属真核单细胞生物，主要生长在偏酸含糖量较高的环境中，在酒精、饮料等生产中有重要用途。 种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母、红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪酶等。

  25. 啤酒酵母 红酵母

  26. 面包酵母

  27. 2. 常见的工业微生物 E. 噬菌体 是一种感染原核生物的病毒。分烈性噬菌体和温和噬菌体。能严重危害发酵生产。 特点： 形体微小，电镜下才能看到，可通过细菌过滤器。 没细胞结构，独特的生物分子。 营专性活物寄生。

  28. ★ 工业化菌种的要求 （1） 所需培养基易得，价格低廉； （2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等） （3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短 （4）单产高 （选择野生型、营养缺陷型或调节突变株） （5）抗病毒能力强 （6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好 （7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全

  29. 微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。微生物在工业上的用途很广，包括化工、医药、食品、水产、国防、纺织、石油勘探及石油化工等方面。 • 微生物的代谢产物多，已超过1300多种，而用于大规模工业生产的不足100多种；微生物酶有近千种，而工业上用的不过40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖掘。

  30. 3. 工业微生物菌种的分离、选育和改良 A. 菌种的分离 一、菌种分离的一般过程 土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物

  31. 二、采样时要注意的问题 • 气候、水分、空气 • 来源要广 • 结合产品的特点 • 标签：地点、时间、气候等

  32. 极端环境中存在适应环境压力的菌群 (高温、高压、高盐、高pH、低pH、深海) • 土壤中菌种资源最丰富 　　不同土壤中含微生物种群不同 细菌、放线菌（菜园和农田）；酵母（果园树根）； 霉菌（动、植物残骸及腐殖土）。 • 特殊环境中可得到某些特定的类群 　　难降解物、毒物水—分解微生物； 　　死虫肠道－苏云金杆菌； 　　炼油厂附近土－石油分解菌

  33. 三、目的微生物富集的一些基本方法 • 富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。 • 富集的三种方案： • 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 • 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， • 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法

  34. 定向培养的方法 物理方法：加热、膜过滤等 但主要是通过培养的方法

  35. 定向培养的富集方法 1、底物 2、pH条件 3、培养时间 4、培养温度 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。

  36. 四、菌落的选出 • 从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素 • 从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。

  37. 实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 文献:产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌 采样（造纸厂） →80度30分钟处理 ↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落 26株为组成型 从285个土样中获得62株 36株为诱导型

  38. 例：醛肟水解酶的筛选 --Journal of biotechnology 94(2002), 65-72 培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离各菌落

  39. 五、目的微生物富集方法的研究进展 • 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。微生物的 • 多样性及资源的开发仍然是今后若干年的研究重点。 2002,陈文新（科学院院士） • 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定目标产物 • 的筛选方面发挥了着越来越重要的作用。如:16sRNA同 • 源性分析，基因序列分析及DNA/DNA杂交技术等 FEMS Microbiology Reviews 26 (2002) 73～81

  40. B. 菌种的选育和改良 目的 • 防止菌种退化 • 解决生产实际问题 • 提高生产能力 • 提高产品质量 • 开发新产品

  41. 方法 基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等

  42. 一、自然选育 自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9 自然突变有两种情况： 一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。 另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。

  43. 自然选育在工业生产上的意义 问题： 高产菌株是正突变高，还是负突变高？ 回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

  44. 自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验

  45. 二、诱变育种 用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。 诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂 { 物理：紫外，快中子 诱变剂 化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍

  46. （一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题 化学诱变剂使用过程的安全性 亚硝酸：0.07M Na2HPO4 亚硝基胍：1M NaOH 诱变剂量的选择 诱变剂的选择 出发菌株的选择

  47. （三）、诱变育种的一般步骤（教材P20） （四）、筛选的方法 • 随机筛选 从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等，筛选而产生的这些特性，称为遗传标记。 • 形态 • 理性化筛选 结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。

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