首届南京流式沙龙

1. www.gotofcm.com www.gotofcm.com www.antibody.cn 首届南京流式沙龙 2003 年 12月19日

2. www.gotofcm.com Tetramer (四聚体) 血小板活化 定量流式细胞术

3. www.gotofcm.com Tetramer(四聚体)

4. www.gotofcm.com Tetramer-原理 内源性抗原 外源性抗原

5. www.gotofcm.com Tetramer-原理 MHC Class I-HLA-A2

6. www.gotofcm.com Tetramer-原理 Allophycocyanin: APC

7. www.gotofcm.com Tetramer-原理 国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105

8. www.gotofcm.com HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽

9. www.gotofcm.com 抗原特异性CTL的分析方法 51Cr释放实验 间接法 需大量的特异性CTLs作为效应细胞 需体外扩增，周期长，敏感性低， 费时费力 难以广泛应用 有限稀释法(LDA) 酶联免疫斑点法(ELISPOT) PCR法 敏感性高 但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测 扩增特异T淋巴细胞受体 Tetramer法 直接法 敏感性高 不受TCR基因型的限制 用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5% 的CD8+细胞对CMV和EBV特异

10. www.gotofcm.com Tetramer法 了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命 检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard) Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cells[J]. Science,1998,280:227

11. www.gotofcm.com Tetramer-应用 感染性疾病 HIV-AIDS, EBV, CMV, HPV, HBV, HCV, Influenza, Measles, Malaria, TB and RSV 肿瘤 Breast, Prostate, Melanoma, Colon, Lung, Cervical, Ovarian and Leukemia 自身免疫性疾病 Diabetes, Lyme disease, Multiple sclerosis, Rheumatoid arthritis, Autoimmune vitiligo 移植 EBV and CMV

12. www.gotofcm.com 1996- 126篇(8篇综述), 机会难得！！！ Tetramer-应用-例证 感染性疾病 • 含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒性感染细胞的清除率无关 • 慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者 肿瘤 • 用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞—用Tetramer分离，富集 移植 • GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败---HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果 • HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力

13. www.gotofcm.com Tetramer-试剂 抗原

14. www.gotofcm.com Tetramer-试剂 MHC 等位型

15. www.gotofcm.com Tetramer-试剂

16. www.gotofcm.com 血小板活化

17. www.gotofcm.com PLATELET Fibrinogen Kit CD41 CD61 活化血小板 Fibrinogen 静止血小板 CD41/61复合物变形与Firbrinogen结合，为初期血栓形成的关键步骤

18. www.gotofcm.com PLATELET Fibrinogen Kit 应用 • 心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等) • 监测抗凝集治疗(如RepPro, Integrelin, Plavix, Ticlid等) • 检测GPIIb/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能力 标本处理 • 血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力 • 血小板活化状态(ex vivo)

19. www.gotofcm.com 定量流式细胞术

20. www.gotofcm.com 血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit

21. www.gotofcm.com 血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit 特点 • 可定量与血小板相关的任何抗原(如CD41, CD61, CD42a等) • 免洗 • 间接法 • 一抗亚型为IgG1, IgG2a或IgG2b • 定量范围宽(500-90,000 分子/血小板 ) • 定量准确，CV值(变异系数)小

22. www.gotofcm.com 血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit 标准曲线

23. www.gotofcm.com 血小板表面抗原定量- PLATELET Calibrator Kit 结果

24. www.gotofcm.com 白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit

25. www.gotofcm.com 白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit 特点 • 可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3, CD4, CD55, CD59等) • 单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数) • 多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+ T细胞上CD28分子数) • 全血和分离的细胞(如细胞株等)均可 • 间接法 • 一抗亚型为IgG1和IgG2a • 定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞 ) • 定量准确，CV值(变异系数)小

26. www.gotofcm.com 白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit 标准曲线

27. www.gotofcm.com 白细胞表面抗原定量- CELLQUANTTM Calibrator Kit 结果

28. www.gotofcm.com 最新技术 计数血液中循环内皮细胞的标准方法

29. www.gotofcm.com CELLQUANT FF-CD146 循环内皮细胞(CEC)增加于 • 急性冠状动脉综合征 • 血小板减少性紫癜 • 镰刀细胞贫血 • 败血症 • 狼疮 • 肾病综合征 • 器官移植排斥 • 手术创伤 • 癌症 传统方法 显微镜检，手工计数。费时，费力，无法标准化

30. www.gotofcm.com CELLQUANT FF-CD146 新技术—新标准 • 免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合 • 仅需1 mL血 • 整个过程不到1个小时 • 灵敏度高：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞 • 重复性好，室间差(Interlaboratory CV)小

31. www.gotofcm.com CELLQUANT FF-CD146 方法 • 将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育 • 富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶) (确定有核细胞) CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰) CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点) 标准浓度微球(用于绝对计数) • 流式分析(循环内皮细胞鉴定) 有核细胞(PI+); CD45-; CD146+;前向散射角(FSC)范围宽

32. www.gotofcm.com CELLQUANT FF-CD146 PI-CD45 FITC

33. www.gotofcm.com CELLQUANT FF-CD146 PI-CD45 FITC

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