חשיבות אינטראקציות לוקאליות לעומת רחוקות ומקומן בקיפול החלבון

1. חשיבות אינטראקציות לוקאליות לעומת רחוקות ומקומן בקיפול החלבון מגישות: מירב לוי טל תנעמי מנחה: דר' ינאי עופרן קורס: סמינריון- ביולוגיה חישובית אוניברסיטת בר אילן

2. רקע • 3 רמות קיפול לשרשרת החלבון: מבנה ראשוני – רצף חומצות האמינו מבנה שניוני – סלילי α ומשטחי β, מבנים לוקאליים מבנה שלישוני – התקפלות נוספת ליצירת המבנה התלת מימדי הסופי.

3. פרדוקס לוינטל: אם חלבון ינסה למצוא את המצב באידיאלי עבורו מבחינה אנרגטית ע"י מעבר ממצב אחד למצב אחר הנמוך ממנו באנרגיה החופשית עד לתחתית... הזמן שייקח לו לשם כך עולה על גיל היקום. לדוגמא- • נתבונן בחלבון המורכב מ-100 ח"א. • נניח שכל ח"א יכולה להסתדר במרחב ב-10 קונפורמציות, המוגדרות ע"י זוויות Φ ו-Ψ. • נקבל 10100 קונפורמציות אפשריות. • אם חלבון מתקפל ע"י "ניסוי וטעייה" (מעבר על כל הקונפורמציות האפשריות) • ידרשו ~1077שנים לחלבון להגיע ל – Native State. אם כן, כיצד חלבונים מתקפלים כה מהר????

4. התיאוריות בנושא 1. רצף החלבון מתחלק למסגרות לוקאליות קטנות, מסגרות אלו מתאחדות למבנה שלישוני כולל. לפי תיאוריה זו, הקשרים המובילים את קיפול החלבון הם קשרים לוקאליים. 2. תחילה ישנן אינטראקציות ספציפיות בין חומצות אמינו רחוקות לפיהן נקבע השלד. מכאן שהקשרים החשובים לקבלת המבנה הרצוי הם קשרים בין חומצות רחוקות. 3. תיאורית הקריסה ההידרופובית: המפגש של החלבון עם הממס כופה על החלבון להתקפל בצורה מסויימת.

5. מטרת הפרויקט • ברצוננו היה לבחון האם קיימות ראיות אבולוציונית התומכות בתיאוריה השניה, לפיה: ישנן אינטראקציות ספציפיות בין חומצות אמינו מרוחקות על פני רצף החלבון, אינטראקציות אלה מתרחשות בשלב מוקדם של קיפול החלבון והן אלו שמכתיבות את המבנה הכללי. • הנחה המקובלת היא ששמירות אבולוציונית = חשיבות. אם אינטראקציה היא חיונית לקבלת חלבון פעיל, חלבונים בהם היא לא מתאפשרת לא ישרדו וצורה זו של הרצף לא תישמר. לכן, בדקנו האם חומצות אמינו השותפות באינטראקציות בין חומצות מרוחקות נשמרו יותר במהלך האבולוציה, מה שיכול להעיד על היותם מרכזיים בתהליך קיפול החלבון.

6. שלבי עבודה • שלב א': הצבעה על חומצות אמינו השותפות באינטראקציות לוקאליות ומרוחקות. זאת על ידי ניתוח הנתונים של מבנה החלבון, הנמצאים במאגר הנתונים pdb. • שלב ב': השוואת השמירות האבולוציונית שלהן, לפי הנתונים הנמצאים במאגר hssp. מאגר זה מכיל multiple alighment עבור חלבונים בעלי מבנה שלישוני ידוע.

7. ניתוח קבצי pdb בעזרת קבצי ה PDB חישבנו מרחקים בין אטומים מחומצות שונות. ההנחה היא שאטומים קרובים במרחב "מרגישים" זה את זה. כלומר,מקיימים אינטראקציה. השתמשנו בערכי סף מקובלים לקביעת אינטראקציה : 3.5 Å-6.5 Å. תרגמנו אינטראקציות בין אטומים מחומצות שונות לאינטראקציות בין חומצות אמינו. מעתה, כשנזכיר אינטראקציה כוונתנו לאינטראקציה בין חומצות אמינו שונות.

8. את האינטראקציות סיווגנו לשתי קבוצות על פי המרחק בין החומצות על פני רצף החלבון . • אינטראקציות לוקאליות- אינטראקציות בין חומצות הנמצאות קרובות על פני הרצף. הגדרנו את ערכי הסף להיות רווח של 3-6 חומצות. • אינטראקציות רחוקות– אינטראקציות בין חומצות רחוקות על פני הרצף. ערך הסף היה רווח של לפחות 21 חומצות. עבור כל חומצה בדקנו בכמה אינטראקציות מכל סוג היא שותפה, אם בכלל.

9. קבצי HSSP • מאגר זה מכיל התאמה מרובת רצפיםעבור חלבונים שהמבנה השלישוני שלהם פוענח. • מתוך המאגר נוכל למצוא את השמירות של כל מיקום ברצף. • הבחנה חשובה: שמירות של עמדה בחלבון עם ~40% זהות, משמעותית הרבה יותר משמירות של עמדה בחלבון עם ~ 90% זהות. • כיוון שהמטרה היא להשוות בין שמירויות של עמדות בהתאמות שונות, יש צורך לבצע סינון על מאגר הhssp ע"מ ליצור קבוצה של התאמות דומות ככל היותר. לכן, ביצענו סינון של החלבונים ובחרנו רק את החלבונים העונים לתנאים מסוימים ועליהם ביצענו את האנליזה.

10. הסינון שבחרנו לבצע: • התאמות בהם משתתפים לכל הפחות 50 חלבונים. • התאמות בהן אחוז ההתאמה של הרצפים השונים לרצף המקורי מפוזר על פני הטווח באופן דומה: • לפחות 25% חלבונים עם אחוז דמיון ≥ 70%. • לפחות 25% חלבונים בטווח 70%- 40%. • לפחות 25% חלבונים רחוקים, אחוז דמיון < 40%. • לא יותר מ10% חלבונים קרובים מאוד (מעל 95%). • בנוסף, במקרה שיש חלבונים שבניהם אחוזי דמיון גבוהים(מעל 95%), נבחר רק אחד מהם לביצוע האנליזה, לדוגמא:

11. ה HSSP מכיל עבור כל מיקום ברצף נתון weight = משקל השמירות. ערך זה מסמל עד כמה העמדה נשמרה ברצפים השונים שהשתתפו בהתאמה, ככל שהעמדה נשמרה יותר, כלומר הפיזור של חומצות האמינו שנמצאו בה נמוך יותר- ערך זה יהיה גבוה. בשלב הבא, חישבנו עבור כל חלבון מהו ממוצע השמירות של חומצות שהשתתפו בקשרים רחוקים ואת ממוצע השמירות של חומצות שהשתתפו בקשרים קרובים.

12. תוצאות • ב- 796 חלבונים מתוך 807, ממוצע השמירות עבור קשרים מסוג NON-LOCA היה גבוה מהממוצע עבור קשרים מסוג LOCAL.

13. בחינת התוצאות • לאחר שראינו שמדובר בשתי אוכלוסיות נרצה לוודא (עד כמה שניתן) כי השוני אכן נובע מאופי הקשרים ולא מסיבות אחרות. • סיבות אפשריות לשמירות אותן נרצה לדחות: • מקובל כי חומצות קבורות, כלומר לא חשופות לממס הינן שמורות יותר מחומצות חשופות. • ישנו יסוד סביר להניח כי חומצות השותפות במספר רב של אינטראקציות, יהיו יחסית שמורות.

14. נרצה אם כן, לחזור על האנליזה עבור קבוצות שונות של חומצות ונבדוק האם בכל אחת מהקבוצות ניתן יהיה להבחין בהבדל שנצפה באנליזה הכללית. הקבוצות שנבחן: • חומצות קבורות (לא חשופות לממס). • חומצות חשופות לממס במידה רבה. לקבלת מידע על חומצה האם היא חשופה לממס או לא. השתמשנו במאגר הנתונים dssp. • חומצות השותפות במספר אינטראקציות דומה.

15. ב- 755 חלבונים מתוך 806, ממוצע השמירות עבור קשרים מסוג NON-LOCAL היה גבוה מהממוצע עבור קשרים מסוג LOCAL. עבור קבוצת החומצות הקבורות לא נמצא הבדל משמעותי. אך ניתן להסביר זאת בכך שחומצות אלו ידועות כשמורות באופן בולט, והאנליזה שנעשתה אינה מספיק רגישה להבדלים קטנים. בדיקה עבור חומצות חשופות

16. חומצות השותפות ב 17 אינטראקציות ומעלה. • ב- 763 חלבונים מתוך 809, ממוצע השמירות עבור קשרים מסוג NON-LOCAL היה גבוה מהממוצע עבור קשרים מסוג LOCAL.

17. אנליזות נוספות • בנוסף לאפיון רמת השמירות של הקשרים השונים. (local ,non-local) רצינו לאפיין את סוגי הקשרים בכל קבוצה. חישבנו עבור כל קשר את התדירות שלו,זאת לפי הנוסחא: את הנתונים הזנו ל- heat-map .

18. Non-Local Local -0.5 0 0.5 1 1.5

19. סיכום מטרה: רצינו לבדוק האם קיימות ראיות אבולוציונית התומכות בתיאוריה לפיה קשרים רחוקים מתרחשים עם תחילת קיפול החלבון ומכתיבים את המשך קיפול החלבון. בנוסף, ניסינו לאפיין את סוגי החומצות המשתתפות בכל אחד מהקשרים. תוצאות: • מצאנו כי חומצות השותפות בקשרים רחוקים שמורות יותר מאלו השותפות בקשרים קרובים. אבחנה זו נשמרה גם בתוך קבוצות מבחן שונות. • נצפה הבדל בין שתי קבוצות אלו גם מבחינת סוגי החומצות המשתתפות בקשרים. מסקנות: ניתן להסיק שיש לקשרים רחוקים חשיבות משמעותית. ישנו יסוד סביר לחשוב שקשרים אלו מתרחשים בשלב די מוקדם בהתקפלות החלבון היות ואם הם חשובים יש להבטיח את קיומם ולא לאפשר קיפול אחר.

20. נקודות אפשריות למחקר בעתיד: • חידוד האנליזה כך שתהיה פחות רגישה לרעש. • המשך בניסיונות לאפיין את 2 קבוצות הקשרים.

21. תודות • לדר' ינאי עופרן על הליווי המקצועי והסבלנות. • לחברי המעבדה על העזרה.