استاندارد سازي آزمايشات التور

1. استاندارد سازي آزمايشات التور به نام خداوند جان آفرين خرداد1391

2. تعريف بيماري وبا وبا يا كلرا بيماري حادي است كه در نتيجه آنتروتوكسينويبريوكلرا که بر روي سلول های پوششی مخاط روده باریک اثر و باعث فعال سازی آنزیم آدنیلات سیکلاز مي شود ايجاد مي گردد، بيماري به شکل دفعمقادیر فراوان آب و الکترولیت است که درصورت عدم درمان به شوك هيپوولميك ، اسيدوز متابوليك ، ومرگ بيمار منجر مي گردد. دراشکال خفيف، بيماری در عرض يک هفته بهبود می يابد و در موارد شديد ميزان دفع مايع به يک ليتر در ساعت می رسد و در عرض 6 ساعت ممکن است به شوک ، کلاپس عروقی و عوارض کليوی ، قلبی ، تنفسی ، اسيدوز و مرگ منجر گردد.

3. انتشار بيماري انتشار اين بيماري درروستاها از طريق آب رودخانه ها، جويبارها وچاههاي كم عمق، و درشهرها از طريق آب لوله كشي خوب تصفيهنشده يا آلودگي مجدد وبين راهي آبهاي لوله كشي به وسيله فاضلاب، صورت مي پذيرد . • بيماري التور بيشتر در شهرها رخ داده وميزان مرگ ومير آن طي همه گيريها 2/1 % مي باشد.

4. اتيولوژي عامل بيماري متعلق به جنس ويبريواز خانواده ويبريوناسيه ها، باسيل گرم منفي، ويرگول مانند، هوازي، داراي توانايي رشد در37 درجه سانتيگراد ، بدون تاژك، اکسيداز مثبت،داراي حركات نيزه اي در زير ميكروسكوپ زمينه تاريك مي باشد.

5. ويبريوهای پاتوژن 1- ويبريو پاراهموليتيکوس : با تهاجم به روده به بيماری اينويزيو ( تهاجمي ) می انجامد . 2- ويبريو کلرا : بدون تهاجم روده ای با ايجاد آنتروتوکسين موجب بروز اسهال می گردد

6. ويبريو کلرا اسپور ندارد لذا درمقابل گرما و خشکی درعرض چند ساعت ازبين می رود. • ويبريو التور در فاضلاب تا بيش از يک ماه مقاومت دارد. • دربرابر مواد شيميايی مانند فنول 1% ، پرمنگنات پتاسيم 2/. گرم درليتر درعرض چند دقيقه از بين می رود.

7. Bio Typing 1- بيوتيپ کلاسيک: که براساس تفاوتهاي آنتی ژن O يا سوماتيک تقسيم می گردد . سروتيپ هاي O1,O139 عامل وبا به حساب مي آيند . بيوتيپ کلاسيک خود به 3 سروتيپ اگاوا Ogava ، اينابا Inaba ، هيکوجيما Hikojima، تقسيم می گردد . 2- بيوتيپ التور : • دارای خاصيت هموليتيک می باشد. • دربرابرپلی ميکسين B مقاوم می باشد. • گلبول قرمز جوجه را آگلوتينه می کند. • مقاومتر است و به مدت بيشتری در محيطآب زنده می ماند.درجات خفيف وکم تا بدون علامت بيماریبا وبای التور بيشتر ملاحظه می گردد ممکن است باعث ايجاد حاملی مزمن گردد.

8. NAG ( Non agglutinating ) : ويبريوهايي هستند كه قادر به ايجاد بيماري شبه وبا ميباشند ، با آنتيسرم O1 آگلوتينه نمي شوند ومتعلق به گروههاي آنتي ژني O متفاوتي هستند .

9. منابع ، مخازن ، انتقال و سرايت : • انسان تنها ميزبان شناخته شده مهم وبا است هرچند که ممکن است مخازن محيطی نيز وجودداشته باشد. • هربيمار ممکن است طی بيماری 1 تا 60 ليتر مايع ( متوسط 10 تا 20 ليتر ) دفع کند و در هر ميلی ليتر مدفوع 100 هزار تا يک ميليارد ويبريو دفع نمايد بنابراين به سرعت می توانند محيط خود( معمولا محل سکونت) را الوده کند. • انتقال: 1- ازطريق آب آلوده به مدفوع و مواد مستفرغه 2- از طريق آب آلوده به مدفوع حاملان با وسعت کمتری 3- از راه خوردن موادغذايی آلوده به آبهای کثيف ، مدفوع ودستهای آغشته به خاک آلوده 4-از طريق مگس 5- خوردن برخی خرچنگها و ماهيهای صيد شده از آبهای آلوده

10. عوامل موثر در بررسی یک طغیان 1- بررسی اپیدمیولوژی 2- بررسی و تجزیه تحلیل آزمایشگاهی 3- بررسی محیطی

11. نقش آزمایشگاه در طغیان 1-تائید تشخیص بالینی از طریق جداسازی تعیین هویتعامل بیماری 2-جداسازی عامل بیماری از نمونه هاي باليني، محیطی و مواد غذائی 3-پیدا کردن مخزن بیماری 4-تعیین مقاومت میکروبی 5-بررسی روند مقاومت میکروبی

12. نمونه گيري 1- بهتر است نمونه گیری مدفوع در مراحل اولیه بیماری در 2تا 3 روز(حداکثر 4روز) اول بيماري که عامل بیماری زا به تعداد زیاد در مدفوع وجود دارد انجام گردد. 2- نمونه گیری بایستی قبل از تجویز آنتی بیوتیک انجامشود.

13. (حجم نمونه)نمونه گیری 1- اصولاً نمونه مدفوع (در صورت قوام دار بودن حداقل 5 گرم و یا در صورت آبکی بودن معادل 5 سی سی) نسبت به سواب برتری دارد و حداقل دو نمونه سواب مقعدی و یا سواب از مدفوع تازه برای هر بیمار جمع آوری و در محیط کری بلر تلقیح و ارسال گردد. 2-در موقع طغیان نیاز به نمونه گیری از همه بیماران نمی باشد و حداقل 10 نمونه کفایت میکند.

14. سواب مقعدی برای نمونه گیری با سواب از سواب پنبه ای سالم استفاده کنید و دقت شود تا پنبه سر آن کنده نشود. ابتدا سواب را با فرو کردن در محیط ترانسپورت مرطوب کرده و سپس به اندازه 2/5 الی 3/5 سانتی متر داخل اسفنکتر رکتوم نموده و بچرخانید و بیرون کشیده و مطمئن باشید که سواب به مدفوع آغشته شده باشد . از هر بیمار حداقل دو عدد سواب تهیه کنید.

15. تهیه نمونه مدفوع و سواب مدفوع 1- برای تهیه نمونه مدفوع از یک ظرف تمیز و با اندازهمناسب و دردار استفاده شود. 2-در صورت عدم دسترسی به ظروف یکبار مصرف، حتما از ظرف تمیز استفاده شود. 3-هنگامی که نمونه به آزمایشگاه می رسد لازم است به سرعت آزمایش شود بطوریکه از زمان جمع آوری نمونه تا آزمایش آن بيش از 2 ساعت نگذشته باشد. 4-اگر ناچار به نگهداری نمونه بیش از دو ساعت هستید، سوابی را درون نمونه مدفوع قرار داده و پس از حرکت چرخشی آن را در یک محیط انتقالی تلقیح کنید. 5-اگر مدفوع حالت مخاطی دارد سعی کنید نمونه را همراه با مخاط در محیط ترانسپورت تلقیح نمائید.

16. تلقیح نمونه به محیط انتقال 1- همانطوریکه قبلا گفته شد حداقل دو سواب مقعدی را به ته لوله محیط انتقالی وارد کنید. 2-پس از فرو بردن سواب در داخل محیط انتقالی قسمت چوبی سواب را که خارج از لوله قرار میگیرد بشکنید. 3- در لوله را کامل ببندید. 4-نمونه ها را داخل یخچال نگهداری کنید و اگر امکان گذاشتن آنها در یخچال نباشد آنها را در جای خنک و دور از نور خورشید جهت پائین نگهداشتن دما قرار دهید. محیط انتقال حاوی سواب مدفوعی و یا مقعدی را می توان حد اکثر 48 تا 72ساعت در دمای یخچال نگهداری نمود و در صورت عدم امکان انتقال نمونه ظرف مدت تعیین شده به آزمایشگاه ،آنها را ترجیحاً در فریزر 20- و یا در صورت عدم دسترسی در فریزر های خانگی (15 – الی8 1-)نگهداری کرد.

17. انواع محیط های انتقال محیط های کشت انتقالی زیادی بصورت تجارتی وجود دارد که به چند تا از آنها اشاره می شود: 1- کری بلر 2-استوارت 3- امیز 4-بافر گلیسیرین سالین

18. محیط انتقالی کری بلر محیط انتقالی کری بلر نسبت به بقیه محیط ها ارجحتر و قابل دسترسی می باشد . اگرمحیط کری بلر طبق دستور العمل شرکت سازنده تهیه گردد ( استريل نمودن محيط هاي ساخته شده بوسيله بخار آب جوش به مدت 15 دقيقه) و پس از تهیه اگر در دمای پائین نگهداری شود تا یکسال قابل استفاده می باشد بشرطی که خشک نشده باشد.

19. انتقال نمونه ها از ساير نمونه هائي كه ممكن است جهت آزمايش به آزمايشگاه ارسال شوند مي توان نمونه هاي استفراغ و نمونه هاي سرم بيماران را نام برد. به دقت لوله های حاوی نمونه را بپوشانید و سپس در جعبه ای که به هنگام ارسال شکسته نشود بسته بندی کنید .در صورت ارسال با پست مقررات بین المللی را در نظر بگیرید و از دو بسته بندی استفاده نمائید. بسته درونی ( غیر قابل نفوذ) و بسته بیرونی که از شکستن لوله ها جلوگیری می نماید .بر روی هر لوله اطلاعات مربوط به هر بیمار را ثبت کنید.

20. نمونه برداری از مواد غذائی :نکات مورد توجه و لازم در مورد نحوه نمونه برداری 1-اطمینان از استریل بودن و تجهیزات نمونه برداری 2-نمونه برداری بایستی در شرایط استریل وترجیحا در مجاورت حرارت انجام گردد. 3- نمونه یا نمونه های گرفته شده نماینده کل مواد غذائی مشکوک باشد.

21. نمونه برداری از مواد غذائی • مواد غذائی جامد و نیمه جامد حداقل 100و حداکثر 300 گرم • مواد غذائی مایع حداقل250و حد اکثر 500 سی سی • مواد غذائی کنسرویارسال یک قوطی و یا ظرف همچنین داشتن نمونه شاهد که در دماي 18- درجه سانتی گراد نگهداری می شود برای انجام آزمایش های مجدد ضروری است.

22. :تشخيص آزمايشگاهي التور • Direct microscopy • No WBC • No RBC • No normal flora • Vibrio motility (invert drop) • Apperace of specimen • Culture • First TCBS • Alkalin pepton water( pH8/4-9 ) (4 -6hours in 37ºc) • Second TCBS • TSI or KIA • Oxidase test &… • Serotyping • 1 drop for O1(1 drop for inaba /1 drop for ogawa /1 drop for control ) • 1 drop for O139 • 1 drop for negative control

23. TCBS • تیوسولفات سیترات بیل سوکروز آگار، محیطی بسیار انتخابی و افتراقی برای ویبریو کلرا که در زمان تهيه نیازی به اتوکلاو کردن ندارد. • پرگنه های ویبریو به دلیل تخمیر سوکروز در این محیط زردرنگ می باشند. • ارگانیسم هایی همچون ویبریو پارا همولیتیکوس که سوکروز را تخمیر نمی کنند پرگنه هایی به رنگ سبز تا آبی متمایل به سبز ایجاد می کنند. • توجه: از زمان تهيه TCBSنبايد بيش از يک هفته گذشته باشد همچنين محيط بايد در کيسه هاي فريزر در يخچال نگه داري شوند. • پس از مدت زمان انکوباسيون در صورت مشاهده کلني هاي صاف زرد رنگ و براق به قطر 2-4 ميلي متر در محيط TCBS کلني را در محيط KIAکشت داده (18-24ساعت در دماي 37-35 درجه ) گرماگذاري نماييد.

24. تستهاي کليدي در تشخيص ويبريو کلرا

25. روش ساخت معرف اکسيداز: • تترا متيل فنيلين دي آمين دهيدرو کلرايد : 0/05 گرم در cc 5 آب مقطر ( براي حل کردن از حرارت استفاده نکنيد ) • هر بار که محلول معرف تهيه مي شود با شاهد مثبت ) سودوموناس) و شاهد منفي((Ecoli کنترل کيفي کنيد. • محلول اکسيداز بايد هر روز تازه تهيه شود و قابل نگهداري نمي باشد. • جهت انجام تست اکسيداز از کلنيهاي رشد کرده بر روي محيط TCBSاستفاده نکنيد (نتايج مثبت و منفي کاذب).

26. روش انجام تست اکسيداز : • دو تا سه قطره از معرف اکسيداز را روي تکه کاغذ صافي در پتري ديش قرار دهيد . • کشت را با اپليکاتور چوبي در سرتاسر کاغذ مرطوب بگسترانيد. • در واکنش مثبت باکتري بي درنگ به رنگ ارغواني تيره در مي آيد. • ارگانيسم هاي اکسيداز منفي بي رنگ مي مانند يا پس از 10 ثانيه به رنگ ارغواني در مي آيند.

27. Oxidase test

28. String Test • آزمون رشته بخصوص برای رد کردن گونه های غیر ویبریويی به ویژه گونه آئروموناس مفید است. • تهیه سوسپانسيونی از کشت تازه KIA در قطره ای از محلول آبی 0/5% دزوکسی کلات سدیم • DNA یاخته های لیز شده که منجر به لزج شدن مخلوط می گردد،هنگام کشیدن حلقه، رشته موکوییدی تشکیل می شود. • آزمون رشته سوش آئروموناس منفی میباشد.

29. KIA • مطابق دستور سازنده تهیه کنید. • پس از اتوکلاو کردن بگذارید بصورتی جامد شود که در ته لوله 3 سانتی متر و شیب آن نیز 3 سانتی متر باشد. • درپیچ لوله را محکم نمایید. • هر سری جدید باید کنترل شوند: اشرشیا کلی شیب و ته اسیدی همراه با گاز و بدون تولید H2S شیگلا فلکسنری شیب قلیایی ته اسیدی بدون تولید گاز یا H2S

30. Sim • کشت روي محيط SIM که در صورت مثبت بودن نمونه از نظر ويبريو واکنشهاي ذيل مشاهده مي شود: • SH2- • Motility + • +Indole

31. lia • به منظور غربال کردن و کنار گذاشتن ائروموناس و برخی گونه های ویبریویی که بر خلاف ویبریو کلرا لیزین را دکربوکسیله نمی کنند • ویبریو کلرا : شیب اسیدی (زرد)- ته قلیایی(بنفش)بدون گاز (LDC+,LDA-) • پروتئوس : شیب قلیایی و ته اسیدی( دآمینه شدن لیزین) (LDA+,LDC-)

32. تستهاي سرولوژي ‍ • جهت انجام تستهاي سرولوژي ضروري است از کلني هاي تازه که در محيط KIA يا SIM رشد کرده اند استفاده شود و از کلنيهاي موجود در محيط TCBS استفاده نشود

33. تائيد تشخيص: • انتقال 5 مورد مثبت به آزمايشگاه مرکز بهداشت استان جهت تاييد تشخيص( نمونه رشد کرده در محيط KIA با رعايت اصول ايمني و شرايط استاندارد بسته بندي و با حفظ زنجيره سرد ارسال شود )

34. باآرزوي سلامتي و موفقيت براي شما