第八节 研究 DNA 与蛋白质相互作用的方法

1. 第八节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法 8.1 凝胶阻滞试验（Gel Retardation Assay） 原理 又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 EMSA ( Electrophoretic Mobility Shift Assay ) 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离是同其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也就相在缩短了。所以当特定的DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋白质分子发生了结合作用。

2. 凝胶阻滞试验方法 用放射性同位素标记待检测的DNA片段（亦称探针DNA 加DNA结合蛋白 同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA一蛋白质复合物 将它加样到非变性的凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离 如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部；反之，将会形成DNA一蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。所以也称这种试验为条带阻滞试验（band retardation assay）。 应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置

4. 凝胶阻滞试验用途 鉴定特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质分子（比如特异的转录因子等） 研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性：其办法是在DNA一蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。如果竞争同一种蛋白，由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA处于自由状态，自显影图片上不出现阻滞的条带，相反，如果不竞争同一蛋白，探针DNA仍与特定蛋白复合，呈现阻滞的条带。 使用竞争DNA，可间接阐明体内的DNA与蛋白质的相互作用。如，使用一种具有与已知转录因子结合位点的竞争DNA，就可以判断检测到的蛋白质是否属于此类转录因子，或是与之相关的其它转录因子；如果事先引入突变，可以检测突变对其与转录因子结合作用的影响。

6. SND1, a NAC Domain Transcription Factor, a Key Regulator of Secondary Wall Synthesis in Fibers of Arabidopsis • NAC (NAM, ATAF1,2, CUC2)

7. SND1 Specifically expressed in InterfascicularFibers and Xylem Cells

11. MYB46 Gene Is Predominantly Expressed in Fibers andVessels in Arabidopsis Inflorescence Stems

12. Expression of the MYB46 Gene Is Regulated by SND1

13. SND1 could bind to MYB46 Promoter

16. 由“钓鱼”引发“钓蛋白”

17. A B X C O A V R D B A O F P A Z M A A Q Yeast One Hybrid Reporter Bait DNA Expressed Protein Library Prey

18. clone element into a reporter construct and make stable yeast strain • transfect aliquots of cDNA expression libraries that have fragments of DNA fused to yeast activator • if the fusion protein binds to your element then the reporter gene will be activated

19. Prolamin-box及其结合蛋白

21. 指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX) • SELEX技术起源于20世纪90年代初 • 通过该技术可以自起始寡核酸库中获得能够与靶分子（蛋白或小分子）具有高亲和力的特异性核酸序列 SELEX技术操作流程包括： （1）人工合成库容量为1014-1015的随机核酸库，每条序列均包括两端的恒定序列区及位于序列中端的随机序列区，其中随机序列区长度为20-40个碱基； （2）与靶物质转录因子蛋白相作用，形成核酸-转录因子蛋白复合体； （3）将不能与靶物质结合的核酸序列分离出来； （4）复合体中的核酸序列利用PCR反应进行扩增； （5）重复核酸-转录因子蛋白复合体结合-洗脱-分离过程，直至获得高度富集的序列； （6）将经过筛选得到的核酸序列进行测序，序列拼接比对后确定能够与转录因子结合的保守序列

23. Opaque2 体外进化实验

25. 8.2 DNasel足迹试验 尽管凝胶阻滞试验能够揭示出在体内发生的DNA与蛋白质之间相互作用的有关信息，然而它却无法确定两者结合的准确部位。 要解答这个问题，则需要应用 DNasel足迹试验（footprinting assay）。它是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。

26. DNasel足迹试验过程 • 首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子 • 体外同细胞蛋白质提取物混合。待二者结合之后，再加入少量的 DNasel（它可沿着靶 DNA作随机单链切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条链只发生一次磷酸二脂键的断裂。如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNasel消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等一系列前后长度均仅相差一个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。

27. 从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹” 。

29. 足迹试验的优点 形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。 如果使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。 如同凝胶阻滞试验一样，也可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核酸序列的特异性。

30. DNasel足迹试验发展 目前还出了若干种其它类型的足迹试验。例如，自由羟基足迹试验及菲咯琳铜足迹试验，硫酸二甲脂（DMS）足迹试验等。 硫酸二甲脂（DMS）足迹试验。它所依据的原理是，DMS能够促进DNA中裸露的G甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异的化学切割。假如有一种蛋白质同DNA分子中的某一区段结合，在它的保护下，区域内的G免受六氢吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具这些G残基末端的DNA片段，故出现个空白区域，此即通常所说的足迹。 与其它足迹试验不同，由于DMS足迹试验中被切割的是G残基，因此可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的DNA区段中的特异碱基。

31. 8.3 甲基化干扰试验 应用甲基化干扰试验（methvlation interference assay）技术，可以检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。

32. 甲基化干扰试验的具体操作 先用硫酸二甲脂（DMS）处理靶DNA，控制反应条件，使平均每条DNA分子只有一个G甲基化，而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并作凝胶阻滞试验。经电泳分离之后，从凝胶中切取出具有结合蛋白质的DNA条带和没有结合蛋白质的DNA条带，并用六氢吡啶处理之，于是甲基化的G残基被切割，非甲基化的G残基则不被切割。显而易见，如果某个G因甲基化而不与蛋白质结合，那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的DNA分子上表现出来。相反地，如果一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中不起作用，那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用，则在同蛋白质结合的DNA分子及不同蛋白质结合的DNA分子中均可观察到（图2－44）

34. 甲基化干扰试验的用途 甲基化干扰试验不仅可以用来研究蛋白质与G残基之间的联系，而且同样也可以用来研究DNA结合蛋白质与结合位点中的腺嘌呤A残基之间的联系作用。 头一个办法是使所有的嘌呤残基甲基化，以便同时研究甲基化的G和A残基对蛋白质与DNA结合的干扰效应。 第二种办法是使用焦碳酸二乙脂（DEPC）特异性修饰A，而使之易受六氢吡啶的切割作用。对于研究诸如像具有相对少数G残基的八聚体基序（例如 OCt－1，OCt－2等，它们可与八聚体结合蛋白质结合）这样的序列而言，这些甲基化干扰试验技术具有特别的价值，因为只要研究G残基的甲基化干扰，就可获得有用的信息。

35. DMS化学干扰的主要局限性 它只能使G和A残基甲基化，而不能使T和C残基甲基化。尽管如此，它仍不愧为足迹试验的一种有效的补充手段，可以鉴定足迹区段中DNA与蛋白质相互作用的精确位置。

36. 8.4 体内足迹试验 上面所讨论的这三种方法有一个共同的不足之处，即它们都是在体外进行的试验。因此人们自然会问，这些结果能够确切地反映活细胞内发生的DNA一蛋白质相互作用的真实情况吗？为了解答这个问题，科学工作者又设计出了一种体内足迹试验体系。然而究其实质而言，这种技术无非是体外DMS足迹试验的一个变种而已。

37. 体内足迹试验的方法 用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内的浓度恰好导致天然染色质DNA中的G残基发生甲基化。 而后从这些细胞中提取DNA，并加入六氢吡啶作体外消化。 同体外足迹试验一样，能同某种特殊蛋白质因子结合的DNA区段，其上的G残基就不会被DMS甲基化，因而也就不会被六氢吡啶所切割。 同对照的体外裸露DNA所形成的序列作比较，就会发现由完整的活细胞染色质DNA形成的序列中，缺少了G残基没有被切割的相应条带（图2－45）。

39. 体内足迹试验优缺点 显而易见，与应用克隆DNA片段所作的体外足迹试验的结果相比，经体内足迹试验从染色质总DNA中所获得的任何一种特异DNA的数量，都是微不足道的。因此，有必要通过PCR扩增特异的靶DNA，以获得足够数量的DNA样品。如今体内足迹试验已发展成为研究在完整的活细胞内，DNA一蛋白质结合位点及检测结合位点中碱基突变效应的一种极有效的手段。

40. 应用凝胶阻滞试验、DNasel足迹试验、甲基化干扰试验，以及体内足迹试验等多种用于研究DNA与蛋白质相互作用的基本实验手段应用凝胶阻滞试验、DNasel足迹试验、甲基化干扰试验，以及体内足迹试验等多种用于研究DNA与蛋白质相互作用的基本实验手段 • 有助于深入地探讨基因启动子元件的结构与功能，及其与蛋白质转录因子之间相互作用的有关细节； • 揭示mRNA转录超始和终止的分子本质与主要步骤； • 阐明在发育过程中基因表达调节的时空特异性； • 以及外源基因在转基因植株中表达的分子机理等等。 • 这些研究结果，将为我们提供大量重要的信息，以最终弄清基因表达调节的真实内容。

41. 重要知识点： 1、研究DNA与蛋白质相互作用的方法有哪些？2、凝胶阻滞试验原理是什么？ 3、用图示的方法说明DNasel足迹试验的过程。 4、甲基化干扰试验有什么用途？ 5、什么是体内足迹试验？

42. 第九节DNA的提取与纯化 由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

43. 磷酸 脱氧核糖 含氮碱基 脱氧核苷酸 DNA的化学组成 元素组成： C H O N P 基本单位： 脱氧核苷酸 P 含氮碱基 脱氧核糖

44. A C 腺膘呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 G T 鸟瞟呤脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 组成脱氧核苷酸的碱基： 腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G） 胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T） 因此，脱氧核苷酸也有4种　　　

45. 四种构成DNA的碱基： 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 构成RNA的特殊碱基——尿嘧啶

46. 脱氧核糖核苷酸的组成： + 脱氧核糖 脱氧核苷 碱基 磷酸 脱氧核糖核苷酸

47. 核苷酸的组成： + 核糖 碱基 核糖核苷 磷酸 核苷酸

48. DNA的空间结构 放大 从图中可见DNA具有规则的双螺旋空间结构 DNA的结构模式图

49. DNA分子的结构特点 A T G C A T A T C G G C （1）DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋成双螺旋结构。 A T G C

50. DNA分子的结构 小结 ★化学组成： 一分子含氮碱基 一分子脱氧核糖 基本组成单位：四种脱氧核苷酸 一分子磷酸 两条脱氧核苷酸长链 ★空间结构 碱基对 规则的双螺旋结构 氢键 碱基互补配对原则 ★分子结构的多样性和特异性