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TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS Verónica Fernández Mancebo 2013

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TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS Verónica Fernández Mancebo 2013. TRANSCRIPCIÓN : Es la síntesis de una cadena de ARN Representa a una de las hebras de ADN (hebra codificante) y es complementaria a la que le sirvió como molde. Diferencias para recordar. Repasando…. CROMATINA

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TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

Verónica Fernández Mancebo

2013

slide2

TRANSCRIPCIÓN:

  • Es la síntesis de una cadena de ARN
  • Representa a una de las hebras de ADN (hebra codificante)
  • y es complementaria a la que le sirvió como molde
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Repasando…

CROMATINA

Complejo de ADN-proteínas

Proteínas -> histonas (peq ricas en K y R)

->no-histonas (polimerasas, factores de transcr, etc.)

Nucleosoma

Unidad estructural repetida que forma la cromatina

(146pb que envuelve un octámero de histomas)

slide5

Los nucleosomas se conectan por espaciadores de ADN que se llaman ADN de unión o internucleosoma

Los nucleosomas compactan el ADN eucariota, en varias veces su tamaño, permitiendo que quepa en el núcleo del al células

Heterocromatina

Eucromatina (transcripción)

slide6

Síntesis de ARN en eucariotas:

  • ARN polimerasas (I, II y III)
  • Utiliza promotores y tiene un importante uso de “enhancers” (potenciadores)
  • Factores de transcripción (interaccionan con ADN y otros factores)
  • Poca regulación en el punto de terminación
  • Los ARN transcriptos primarios son ampliamente procesados
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Unidad de transcripción

Promotor

5’

3’

3’

5’

-1

+1(Inr)

upstream

(-)

downstream

(+)

La síntesis comienza cuando la ARN-polimerasa

se ubica en el punto de inicio (Inr)

EXPRESIÓN

ARN transcripto primario

ADN

ARN maduro

transcripción

Procesamiento

slide8

ARN pol II

ARN pol I

ARN pol III

En eucariotas existen 3 ARN-polimerasas nucleares

slide9

Punto de inicio

–170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20

Upstream control element

Core promoter

UBF1

UBF1

SL1

TBP

TBP

?

Pol I

ARN polimerasa I

  • Transcribe ARN ribosomal (nucleolo)
  • Está formada por 13 subunidades
  • Necesita la acción de 2 elementos de control (UCE y Core)

Existen muchas (cientos) copias de la unidad de transcripción (todos el mismo promotor)

  • Sintetiza el 80-90% del ARN total de una célula
  • Produce un único ARN transcripto primario
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Procesamiento del pre-rRNA

  • Los cortes son en lugares específicos en una secuencia específica
  • Parece estar ayudada/catalizada por ARN pequeños nucleolares (snoARNs).
  • snoRNAs se asocian a proteínas (snoRNP) (ej. fibrillarina)
  • Metilaciones (Met):
  • Sufre varias metilaciones Por ej 18S: 4Met
  • Posiciones conservadas de los metilos (en determinadas ribosas).

5S: sintetizado por ARNpol-III (nucleoplasma)

no sufre modificaciones

migra hacia el nucleolo para ensamblarse

slide11

Punto de inicio

5’

Oct PSE TATA

3’

Tipo 1

A

C

Tipo 2

A

B

ARN polimerasa III

  • Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) (nucleoplasma)
  • Está formado por 14 subunidades
  • Es la polimerasa con menor producción de ARN
  • Los promotores pueden estar tanto en la región 5’ (snARN) como 3’ (5S y tARN)
  • Los internos: tipo 1 y 2
slide12

Punto de inicio

Punto de inicio

Requiere de varios tipos de factores como TFIII-A, TFIII-B y TFIII-C

TIPO 2 (ejalgtARN)

TIPO 1 (ej 5S)

A

B

A

C

TFIIIC

TFIIIC

TFIIIA

TFIIIC

TBP

TBP

TFIIIB

TFIIIB

TFIIIB

Pol III

Pol III

TFIIIB

slide13

Procesamiento del pre-tRNA

(ARN pol III)

Intrones

*Una endonucleasa corta en los extremos. Se producen dos medias-moléculas de tRNA [5’OH y 3’PO4 cíclico (2’-3’)]

*La reacción de la ligasa de tARN, tiene lugar en tres pasos:

a)Fosforilacióndel 5’OH con el gamma-PO4 del GTP.

b)Formación de un intermediario activado de la ligasa (ligasa-AMP) que transfiere el AMP cíclico al 5’PO4 del sustrato.

c)El PO4 cíclico se abre dando 2’PO4 y 3’OH. Se da la formación del 5’-3’-fosfodiester y el AMP cíclico se libera.

*La fosfotransferasa dependiente de NAD (nicotinamidaadeninadinucleótido) transfiere el 2’PO4 al NAD

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Extremo 5’: endonucleasaribonucleasa P (RNasa P) (enzima-RNP)

Extremo 3’: Cambio de U del extremo por CCA (3’ )

Codón de Tyr

5’-UAC-3’

Anticodón

5’-GUA-3’

  • Agregado de grupos metilos e isopentilos a residuos de purinas
  • Metilación de los 2’OH de la ribosa
  • Conversión de U a residuos de dihidro-U (D), pseudo-U (Ψ) o ribotimidinas (T, metiluridinas)
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ARN POLIMERASA II

  • Transcribe los genes estructurales (prot) a ARNm (y hnARN) (nucleoplasma). Es la enzima que transcribe la más diversa población de ARNs.
  • Múltiples subunidades
  • Se observan 3 grupos de promotores: genéricos, específicose inducibles.
  • Promotores genéricos: secuencia mínima necesaria con la cual la polimerasa puede iniciar la transcripción. No depende de secuencias reguladas por tejidos. Son de baja eficiencia
  • Al menos 8 factores de transcripción (TFII A,B,C,D,E,F,H,J)
  • Condiciones generales para la síntesis de ARN
  • Inr (región iniciadora) puede ser descrita como Py2CAPy5
  • TATA box: secuencia consenso de 8pb a unos ~25pb, rodeado de secuencias ricas en GC. Lo contienen la gran mayoría de los promotores. Se une TFIID/TBP
  • TAF: TBP-associatedfactors
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TFIIH

TFIIJ

TFIIA

TBP

TFIIB

Punto de inicio

P

P

P

P

P

P

TFIIE

P [YSPTSPS]n

TATA

TFAs

ARN Polimerasa II

TFIIF

slide19

La caperuza

  • Implica una condensación de un grupo trifosfato y varias metilaciones.
  • Juega un importante papel en la iniciación de la síntesis de la proteína
  • Protege al ARNm de la degración mientras se está sintetizando el transcripto
  • Involucrado en exportación ARNm al citoplasma
slide20

CAP

cap0

GTP-Met +

*

+ pp + p

cap1

cap2

slide21

La cola de poli(A)

  • Da estabilidad al ARNm en el citoplasma
  • Colabora con la exportación del ARNm
  • Está implicada en la traducción
  • Consecuencia práctica (purificación)
  • Excepción: las histonas
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Remoción de los intrones

(corte-empalme o “Splicing”)

  • Las reacciones son por transesterificación
  • La remoción de los intrones no es secuencial.
  • Involucra partículas de snRNP y otros factores independientes

Formación del “spliceosoma”

slide24

U1: ARN pequeño nuclear (snARN) que forma parte de la partícula snRNP U1, que reconoce el sitio donante (sitio 5’ de “splicing”)

slide25

“Splicing” alternativo

  • Un solo ADN que utiliza diferentes puntos de inicio y finalización de la transcripción, alterando el patrón de “splicing”
  • Existe un solo transcripto de ARN que es empalmado de más de una manera. Los exones son sustituidos, agregados o ignorados.
slide26

“Splicing” alternativo

Diferenciación sexual en Drosophila

La diferenciación sexual en la mosca de la fruta, está regulada por una proteína llamada“sex-lethal”(sxl). 

El embrión hembra expresa la proteína Sxl funcional mientras que en los embriones machos expresan una proteína Sxl no-funcional.

slide27

“Trans-splicing” - Agregado de SL

  • *La secuencia lider (SL) provee un exon extra en el 5’ del transcripto
  • *Es el mismo mecanismo que en el cis-splicingpor transesterificación (pero se genera una molécula de ARN con forma de “Y”)
  • *Esencial en Trypanosoma
  • La región que codifica para la SL es muy parecida al U1 (que falta)
  • Cap 4 (2,2,7-trimetil guanosina y están metiladoslos 4 ntssgtes)
  • *Trans-splicingalternativo (LYT1: nuclear y secretada)
slide28

Ejemplo en mamíferos con la proteína ApoB.

“Editado” del ARNm

  • No hay evidencia que exista otro gen u otro exón
  • Aparentemente el cambio ocurre por una desaminación (C U), por lo que podría estar involucrada una citosinadesaminasa
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Editado usando ARN guías

Mecanismo

Esencial para Trypanosomátidos

slide31

Resumen:

  • ARN polimerasas y esquema de sus promotores
  • Procesamiento de los pre-ARNr
  • Modificaciones en los pre-ARNt
  • Maduración de los pre-ARNm:
    • Cap
    • poli(A)
    • cissplicing(simple, alternativo)
    • transsplicing
    • Editado
  • Esquema de los controles en la expresión génica