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红细胞血型修饰研究

红细胞血型修饰研究. 军事医学科学院野战输血研究所 季守平 高红伟 檀英霞 宫 锋. 一、研究背景. 输血的历史. 1665 ，英国内科医生 Lower ，将大狗的血液输给小狗，成功救活垂死的失血狗。 Lower 被称为输血的发明者。 1818 年 12 月，英国医生布伦德尔首次报道人对人输血，成功救治大出血的产妇。 5/11 人获救。 1870-1871 年普法战争中大量采用输血方式来拯救受伤士兵。. 血型的发现保障了输血安全性. 1900 Landsteiner 发现 A 、 B 、 C(O) 血型 1907 Ottenberg 率先在输血进行交叉配血

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红细胞血型修饰研究

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Presentation Transcript

  1. 红细胞血型修饰研究 军事医学科学院野战输血研究所 季守平 高红伟 檀英霞 宫 锋

  2. 一、研究背景

  3. 输血的历史 1665，英国内科医生Lower，将大狗的血液输给小狗，成功救活垂死的失血狗。Lower被称为输血的发明者。 1818年12月，英国医生布伦德尔首次报道人对人输血，成功救治大出血的产妇。 5/11人获救。 1870-1871年普法战争中大量采用输血方式来拯救受伤士兵。

  4. 血型的发现保障了输血安全性 • 1900 Landsteiner 发现A、B、C(O)血型 • 1907 Ottenberg 率先在输血进行交叉配血 • 1920 在输血前进行交叉配型成为共识 • 1927 Landsteiner 划分A，B，O，AB四种血型。 • 1930 Landsteiner 获诺贝尔生理医学奖 • 1940 Landsteiner和Wiener发现了Rh血型并建立了血型检测的方法。 • ABO与RhD血型检测奠定了输血安全性

  5. 现代检测技术进一步保障输血安全性

  6. 血型仍是影响安全性的主要因素

  7. 战争及突发事件对输血提出更高要求 • 及时输血救治对挽救失血伤员的生命至关重要； • 战时及突发事件中 • 情况危急—来不及配血 • 条件简陋—配血存在困难 —损耗比例高 • 更容易造成偏型 • O型红细胞被称为“通用型红细胞，Universal Red Blood Cell”可以及时、安全救治伤员。

  8. 未来输血的最佳选择－通用型红细胞 临床价值 1.减少输血反应，提高输血安全性； 2.解决血液偏型、减少血液浪费； 3.简化输血程序、提高输血效率； 美国”ZymeQuest”估计至少18亿美元/年. 经济价值 军事和战略 战争、恐怖袭击、巨大灾难等（远离本土）.

  9. 红细胞血型转变的策略 • 酶解血型转变 • 化学物质修饰

  10. 二、酶解血型转变

  11. 酶解转变红细胞血型的原理

  12. （一）.B→O血型转变研究

  13. 研究背景 1982年纽约血液中心Goldstein 从Santos咖啡豆提取高纯度的-半乳糖苷酶，实现B→O血型转变 1994年，Goldstein等克隆了-半乳糖苷酶并在酵母中表达，获得了足量高纯度的工具酶，为临床应用奠定了基础 1995 完成I期临床试验： 2000年完成II期临床试验（(Kruskallet al., Transfusion2000;40;1290-98）

  14. 我们的前期研究 原材料1：人B型血红细胞 原材料2：基因重组α-半乳糖苷酶 • 目的基因、序列、表达载体、宿主细胞 • 工程菌及传代稳定性 • 发酵、纯化制备工艺 • 酶检定（组成、分子量、纯度、免疫鉴别、Km、Vmax等） • 特异比活性、回收率、浓度 • 抗原性及有害物质检查 • 来源 • 质量 • 血型 • 制备 产品——ECORBC 处方、制备工艺、质量检定规程 血型 结构功能 • 综述部分 • 包装材料容器 • 专利 • 国外I/II期参考 • 临床研究计划 细菌、病毒、热源 保存 药效（RBC携氧指标） 急毒（血、尿/猴、猿） 药理毒理 长毒（血、尿/猴、猿） 药代动力学 致癌、致突变、致畸变 免疫原性（α-半乳糖苷酶、B抗体） Chin Med J2007;120(13):1145-1150 溶血/局部刺激 实验室环境 制备工艺 GMP 生产 设备

  15. 海南咖啡豆-半乳糖苷酶的不足 酶用量大 酶解需在酸性环境中进行 酶解工艺相对复杂，需多次调整pH

  16. 新型α-半乳糖苷酶基因的克隆 GLA PCR扩增GAL基因 ATCC25285脆弱类杆菌α-半乳糖苷酶序列测定

  17. 重组酶诱导表达条件优化 M 1 2 3 4 5 6 7 M 0.1 0.2 0.25 0.3 0.5 1.0 1.5 2.0 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 116.0 66.2 45.0 35.0 25.0 18.4 14.4 表达载体：pET-28c-GAL 诱导条件IPTG: 0.1M, 37℃ , 2 h

  18. 新型α-半乳糖苷酶的纯化及等电点鉴定 Supernatant SP-HP Q-XL Marker 等电点:7.1-7.3 二步纯化，纯度>98%

  19. 新型α-半乳糖苷酶生化性质鉴定 最适pH: 5.8 最适温度: 41℃ X=-1/Km 1/V=Km/Vmax*1/s+1/Vmax

  20. 新型α-半乳糖苷酶酶解B型红细胞 O型红细胞 B型红细胞 酶解后B型 红细胞 酶解后 酶解前 凝集反应实验 流式细胞术检测酶解前后红细胞B抗原

  21. 酶解对红细胞结构功能的影响

  22. 新型α-半乳糖苷酶与咖啡豆α-半乳糖苷酶的比较*新型α-半乳糖苷酶与咖啡豆α-半乳糖苷酶的比较* *酶解反应均在柠檬酸-磷酸盐缓冲液中进行，但pH不同

  23. (二）、A→O血型转变研究

  24. A型红细胞抗原的复杂性

  25. A→O血型转变研究背景 1980-2000年，人、家鸡、海鞘、酵母、真菌等α-N-乙酰半乳糖胺相继被克隆，但最适pH在3.5~4.5，特异性低，比活性低，用量大。 2002年Calcutt等从产气荚膜梭菌中克隆并表达了-N-乙酰半乳糖胺酶，可在中性、4℃条件切除A2抗原（仅占A型1％），它的应用价值非常有限。 2008年Zymequest公司报道从微生物中克隆了新型、高效的-N-乙酰半乳糖胺酶，能在室温、中性pH条件下酶切A2抗原，转换1U的RBC仅需20 mg酶。 目前A-ECO的Ⅰa期研究已经完成 A-ECO红细胞体内存活和循环功能正常 受血者体内无抗A酶抗体和抗A(抗原）抗体

  26. α-N-乙酰半乳糖胺酶基因克隆 • 来源：国内临床样本中分离的黄杆菌某些种，革兰阴性，为条件致病菌。 • PCR法克隆：α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-N-acetylgalacto-saminidase，αNAGA)基因全长1335 bp，GC含量39%，编码444个氨基酸，理论分子量52.2kD。 • 比对：DNA 92.6％，氨基酸94.6％。

  27. α-N-乙酰半乳糖胺酶表达载体构建 • PCR扩增表达序列 • pET-22b • BL21 (DE3)

  28. α-N-乙酰半乳糖胺酶纯化工艺优化 - NAGA 纯度>98% - NAGA :1mg/ml

  29. α-N-乙酰半乳糖胺酶的分子量及等电点测定 29

  30. α-N-乙酰半乳糖胺酶理化性质研究 Km ＝63 μM Vmax ＝768 μmol/(L·min) Kcat ＝ 7.47 s－1Kcat /Km ＝ 118.5 (s·μΜ)－1 动力学常数曲线 30

  31. αNAGA的最适温度 15 ℃～45℃ α-N-乙酰半乳糖胺酶理化性质研究 αNAGA的最适pH 最适pH在6-7之间 金属离子及部分化合物对酶比活力的影响 31

  32. 1U 浓缩RBC的酶解 酶解前 酶解后 样本：A(Rh＋) 1U pRBC＋0.9mg A酶，37℃1h

  33. （三）、AB→O血型转变

  34. 酶解缓冲液的选择 甘氨酸缓冲液：1: 250mM的甘氨酸（pH 6.8） 2: 250mM的甘氨酸,3mM NaCl （pH 6.8） 3: 200mM的甘氨酸,3mM NaCl （pH 6.8）(liu) PCS缓冲液： 0.1M柠檬酸45.5ml，0.2M Na2HPO4154.5ml，水115.7ml（pH 6.8） 利用单糖底物测活的结果如下：

  35. α-N-乙酰半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶 在不同缓冲液中与红细胞的结合能力 α-N-乙酰半乳糖胺酶 α-半乳糖苷酶 无细胞对照组 M B O A AB B O A AB B型红细胞 B型红细胞 O型红细胞 甘氨酸1 甘氨酸2 PCS PCS PCS 甘氨酸2 甘氨酸缓冲液 甘氨酸缓冲液 甘氨酸缓冲液 PCS缓冲液

  36. 酶解红细胞所需酶的最低剂量 在甘氨酸缓冲液中B酶的酶解效率比在PCS缓冲液中提高了45倍 AB型红细胞中的A/B抗原比A、B型红细胞内密度低

  37. 使用α-N-乙酰半乳糖胺酶和新型α-半乳糖苷酶在同一缓冲液（中性条件)进行AB →O血型转变 酶解前 酶解后 抗A单抗 抗B单抗

  38. 酶解转变对未来输血模式的影响

  39. 三、mPEG修饰红细胞技术

  40. 血型系统对输血的影响 2012年已知32个血型系统 解决之道： 制备无（稀有）血型的红细胞。 • 输血反应可能性增加 • 稀有血型血液供应不足：(熊猫血：ABRhD-)，突发事件供应紧张; • 配型困难：反复输血的病人（肿瘤、贫血、白血病、AIHA等）

  41. mPEG修饰红细胞表面抗原的原理 原理：PEG及其衍生物与红细胞表面-NH2、-SH2基团结合并形成水 化层，隔离了抗原抗体的结合，但不影响小分子的细胞内外交换。

  42. 5种端基mPEG修饰红细胞血型抗原的比较 mPEG-BTC和 mPEG-SPA是修饰红细胞抗原的最佳衍生物！

  43. 修饰前红细胞的血型 mPEG修饰红细胞血型 mPEG修饰后的红细胞血型鉴定 微柱凝胶法 成功遮蔽了6个稀有血型系统的10种抗原！

  44. A B C mPEG可与红细胞均一反应 Unmodified-RBC FPEG-RBC A: fluorescent image; B: transmission conventional light image; C: merged image of A and B. 激光共聚焦显微镜观察荧光标记的PEG (FPEG)在红细胞膜表面的分布情况

  45. 保存35天后修饰红细胞膜SDS-PAGE碘染色 mPEG与红细胞膜稳定结合 1 2 3 4 5 6 1, 4 蛋白Marker 2，5未修饰的红细胞膜蛋白 3，6 mPEG修饰的红细胞膜蛋白 0 d 35 d

  46. 红细胞膜的完整性不会影响其凝集反应特性 A B 保存21天mPEG-RBC：血影凝集 Unmodified-RBC（A），mPEG-RBC（B）

  47. mPEG修饰不影响红细胞结构和功能　

  48. mPEG修饰的小鼠红细胞的寿命正常

  49. 生理盐水输注组在观察期Hb没有回升到正常值 未修饰血输注组和mPEG修饰血组在观察期Hb回升到正常值 输用mPEG-RBC前后失血小鼠体内Hb水平 失血： 25%

  50. mPEG-RBC有效性试验 盐水输注组 未修饰RBCs输注组 mPEG-RBCs输注组 Transfusion. 2008; 48: 1954-1958

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