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Evgeniy Zavoisky

Evgeniy Zavoisky. 1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR). CuCl 2 ·2H 2 O. Premios Nobel y resonancia.

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Evgeniy Zavoisky

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  1. EvgeniyZavoisky 1944 Universidad estatal de Kazan, Rusia Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) CuCl2·2H2O

  2. Premios Nobel y resonancia • Física 1952 - for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith - Felix Bloch y Edward Mills Purcell • Química 1991 - for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy - Richard R. Ernst. • Química 2002 - for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution - Kurt Wüthrich • Fisiología o Medicina 2003 - for their discoveries concerning magnetic resonance imaging - Paul C. Lauterbur y Sir Peter Mansfield

  3. Resonancia paramagnética electrónica (EPR) • ¿Qué se detecta? • Moléculas con uno o más electrones desapareados • ¿En qué se basa? - Los electrones desapareados tienen momento magnético de spin - El spin electrónico tiene dos números cuánticos que tienen la misma energía en ausencia de campo magnético • Cuando se exponen a un campo magnético se generan dos estados energéticos y por lo tanto una transición Meth. Enz.246: 536

  4. El experimento Energía ms= - ½ Absorción h Campo magnético (B) ms= ½ Primera derivada Señal de EPR Bo Campo magnético (B) Bo Campo magnético (B)

  5. El espectro de EPR E = h = g Bo β g = cociente giromagnético (2.0023 para un electrón libre) β = Magnetón de Bohr (momento angular del electrón; 9.2741 x 10-24 JT-1) Bo = Campo magnético aplicado  ~ 9.75 GHz para la banda X

  6. Desdoblamiento hiperfino • El campo magnético experimentado por el electrón desapareado se ve afectado por los núcleos cercanos que tengan spin nuclear Spin nuclear: 1H  I = ½ 2H  I = 1 12C  I = 0 13C  I = ½ 14N  I = 1 15N  I = ½ Estados energéticos: I = ½: + ½, -½ I = 1: -1, 0, 1 Núm. de líneas = 2n (I + ½) n = núcleos equivalentes

  7. Desdoblamiento hiperfino I = 1 : 14N 1 0 -1 ms mI E 1 0 -1 ½ h -1 0 1 aN aN Desdoblamiento hiperfino -1 0 1 - ½ Campo magnético

  8. Desdoblamiento hiperfino Sin desdoblamiento 1 núcleo I=1/2 (1H) 1 núcleo I=1 (14N) 2 núcleos idénticos I=1/2 1 núcleo I=5/2 (17O) 10 Gauss

  9. El desdoblamiento hiperfino es aditivo aN aN 4-POBN-CH(CH3)OH aH aH aH Campo magnético

  10. Consideraciones acerca de líneas e intensidades • (2 I + 1) líneas por cada núcleo • (2 I1 + 1) (2 I2 +1) …. para más de un núcleo • (2 nI + 1) en el caso de n núcleos equivalentes • El espectro debe ser simétrico con respecto al centro. Si no… • - Más de un radical con valores diferentes de g • - Tiempo de correlación lento • No hay una línea central intensa: número impar de núcleos equivalentes con I = ½

  11. Señales de EPR de iones metálicos de transición • Varían mucho según: • i) el ion metálico • ii) el estado de oxidación • iii) el estado de spin • iv) los ligandos • v) el número de iones metálicos asociados • Depende mucho de interacciones spin-orbital e interacciones spin-spin cuando hay más de un electrón desapareado • A veces necesitan temperaturas bajas para ser detectables (N2 o He líquidos) • Dependen mucho de la simetría alrededor del ion metálico • Observables en iones metálicos con spines semienteros (S = ½, 3⁄2, 5⁄2) pero no en ionescon spines enteros(S =1, 2)

  12. Configuración electrónica de algunos iones metálicos de transición Fe3+, Mn2+ S = 5/2, (alto spin) 3d5 S = 1/2, (bajo spin) Fe2+ S = 2, (alto spin) 3d6 S = 0, (bajo spin) S = 1/2 Cu2+ 3d9 Cu+ S = 0 3d10

  13. Galactosa oxidasa JBC (1988) 263: 6074 Biochemistry (2009) 47:6637

  14. ¿Quién está interesado en EPR para bioquímica? • Áreas relacionadas con estrés oxidativo y antioxidantes • Áreas relacionadas con catálisis enzimática que involucra radicales • Áreas relacionadas con metaloproteínas no enzimáticas

  15. Estrés oxidativo y antioxidantes 1969

  16. Coenzima o cofactor Enzima Chem. Rev. (2006) 106: 3302

  17. Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática Ribonucleótido reductasa (RNR) clase I Fotosistema II YD· YZ· Prostaglandina H sintasa

  18. Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática citocromo peroxidasa RNR clase II RNR clase III piruvato formiato liasa

  19. Radicales de aminoácidos en catálisis enzimática

  20. Metaloproteínas no enzimáticas g ~ 2.07 g ~ 2.08 Sangre venosa Sangre arterial Ax = 17 G g ~ 2.02 80 G Az = 17 G g ~ 1.98 80 G g ~ 2.00 g ~ 1.98 Detección de nitrosil Hb en sangre de ratas tratadas con LPS Kosaka et al., AJP 1994

  21. Detección de radicales en biología por EPR

  22. Espectros de EPR de plasma Plasma Plasma + 0.5 mM ONOO- Vasquez-Vivar et al, Biochem. J, 1996

  23. EPR con flujo continuo Detección de radical carbonato 35% CO3.-+ .NO2 ONOO- + CO2 65% CO2 + NO3- HCO3-/CO2 ONOO- Celda de mezcla 9 mm/ 5 ms Campo magnético

  24. Detección de radical carbonato ONOO- HCO3-/CO2 ONOO- H13CO3-/13CO2 ONOO- + CO2 CO3.-+ .NO2 65% CO2 + NO3- Bonini et al. , JBC 1999

  25. Detección de radical cromanilo Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004

  26. Detección de radical cromanilo Botti et al. , Chem. Res. Toxicol. 2004

  27. EPR directo con muestras congeladas • Aplicable a radicales de vida corta y metales de transición • 77 K (nitrógeno líquido) o 4 K (helio líquido) • Uso limitado debido a la anisotropía

  28. SPIN TRAPPING ST + R.SA. aducto de spin (paramagnético) spin trap (diamagnético) radical transitorio • Gran aplicación pero brinda información estructural muy limitada • Hay dos clases principales de ST: nitronas y nitrosos

  29. Spin traps de nitrona C ( C H ) 3 3 • DMPO (5,5-dimetilpirrolina N-óxido) M e M e R R. + H M e M e N N H . - O O • PBN (fenil-N-t-butilnitrona) R + . R C C C N ( H ) C N 3 3 - H O . O H + Reaccionan con gran variedad de radicales(-RC., RO., RS.) + Los aductos son a menudo muy estables + No son demasiado tóxicos - La asignación estructural es difícil porque los espectros son similares

  30. Spin traps de compuestos nitroso . N O C ( C H ) 3 3 R B r • MNP (2-metil-2-nitrosopropano) . R C ( C H ) O N 3 3 • DBNBS (3,5-dibromo-4-nitrosobencensulfonato) B r . . R - - N O N S O S O O 3 3 R B r B r + Brindan una identificaciónmás fácil del radical - Aductos térmicamente inestables y sensibles a la luz - Forman dímeros inertes - Poco confiables para radicales centrados en oxígeno

  31. Spin trapping con proteínas 20 G 20 G 2 G Espectros de la reacción de HbO2 con peroxinitrito en presencia de MNP: Formación de radicales en la proteína . N O C ( C H ) 3 3 1 mM HbO2 1 mM ONOO- 20 mM MNP R MNP + Pronasa acoplamiento superhiperfino Romero et al., JBC 2003

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