Apoptose

1. Apoptose Olivier Meilhac Unité INSERM 698 CHU X. Bichat Paris 18e Olivier.meilhac@inserm.fr 01-40-25-86-11

2. 1. Introduction Apoptosis - (Gr. "falling") a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer26:239.

3. signaux de prolifération incompatibles avec l’état cellulaire • signaux de mort : • perte des signaux de survie (facteurs de croissance, contacts) - récepteur-médiés - non récepteur médiés Définition – rôle physiologique • « mort cellulaire programmée » • homéostasie : évite l’excès de cellules • éliminer les cellules potentiellement dangereuses • celles qui gênent le développement • événements inducteurs :

4. Déséquilibre  pathologie prolifération apoptose prolifération apoptose • SIDA • Maladies dégénératives • anémie aplasique • troubles ischémiques (infarctus du myocarde…) • maladies du foie induites par toxine (alcool…) • Cancer • Maladies auto-immunes • Infections virales

5. Apoptose vs nécrose

6. Mitochondrial Pathway Death Receptor Pathway FasL ceramide others oxidants Fas/Apo1 /CD95 DNA damage D D Bcl-2 D D D FADD DISC Procaspase 8 dATP Apaf -1 BID Procaspase 9 Cytochrome c Caspase 8 Procaspase 3 dATP Apaf -1 Caspase 9 Cellular targets Caspase 3 apoptosome Hengartner, M.O. 2000. Nature. 407:770. Green, D. and Kroemer, G. 1998. Trends Cell Biol.8:267.

7. 2. Voie extrinsèque Les récepteurs de mort • TNF-R1 TNF • Fas FasL • DR3 Apo3L • DR4 Apo2L/TRAIL • DR5 Apo2L/TRAIL • CAR 1 ? Elimination des cellules en excès ou dangereuses : • développement • apprentissage du système immunitaire • cellules tumorales DD DD DD

8. DISC DD TRADD DD DD FADD DD DED DD DD DED DED DED DED DED Pro-caspase 8 caspase 8 active TNF FasL TNFR1 Fas

9. Les cellules tumorales contre-attaquent 2004, 4:321-6 Le lymphocyte T reconnaît un antigène tumoral (CMH) Il augmente l’expression de FasL, mais la cellule tumorale est résistante Lymphocyte T activé exprimant Fas, c’est lui qui meurt FasL métastase : survie des cellules en milieu immunologique hostile ?

10. Formation de l’apoptosome 3.Voie intrinsèque Elimination des cellules en réponse à une agression modérée : • radiations ionisantes • chimiothérapie • dommages mitochondriaux : oxydants, calcium, céramide Dec 2002. 14(6):715-20

12. activent floppase inhibent translocase

13. Voie extrinsèque voie intrisèque

14. 4. Famille Bcl-2 Curr Opin Cell Biol. 2003 Dec;15(6):691-9. BH : Bcl-2 Homology • BH4 : anti-apoptotique • BH1-3 : pro-apoptotiques BH3-only: pro-apoptotiques indirects Activent les pro-apoptotiques Inhibent les anti-apoptotiques Ex : Bad –Bik : inactivent Bcl-2 et BclXL Bid- Bim : activent Bax et Bak

15. Caspase 8 BID Truncated BID

16. c-myc + Bax + p21waf + Fas, DR5 + cycline G + PUMA/NOXA + gadd45 + APAF1 + mdm2 - Bcl-2… p53 : pro-apoptotique ou arrêt du cycle cellulaire Déficit en facteurs de croissance Lésions de l’ADN p53 transcription apoptose Arrêt du cycle cellulaire

17. Si accumulation de cellules mutantes par perte de controle apoptotique (ex: bcl-2 augmentée, mutation p53)  formation de tumeur

18. 5. Caspases effectrices ou exécutrices • Pas de prodomaine Nter (dépourvu d’activité enzymatique) • 3, 6, 7 • responsables des événements destructeurs caspase cascade

19. Substrats des caspases • 65 en 1998 : • plus de 280 en 2003 • protéines de structure (cytoplasme et noyau) • transduction de signal • transcription / régulation • contrôle du cycle cellulaire • réplication / réparation de l’ADN • spécifiques de certains types cellulaires • conséquence du clivage souvent inconnu • clivage parfois tardif, (accessoire, conséquence de la cascade d’activation) Cell Death and Differentiation, 2003; 10:76-100

20. Substrats en rapport avec les changements morphologiques • ICAD : lève l’inhibition d’une DNAse  fragmentation de l’ADN • ADN hélicase  condensation de la chromatine, remodelage nucléaire • gelsoline  dépolymérisation de l’actine F • kinases ROCK-1, PAK2  P° chaine légère de la myosine • filaments intermédiaires : cytokératine 18, vimentine • organisation des filaments : gas-2, plectine • « tenségrité » : liaison cellules-cellules, cellules -matrice extracellulaire • Fodrine, FAK, paxilline  inh° signaux de survie via intégrines • b-caténine, E-cadhérine, plakoglobine, desmogléine… •  Condensation cellulaire, rétraction, détachement • protéines du RE, Golgi, vésicules de transport • protéines nucléaires  lamina, pores (transport perturbé) •  réparation de l’ADN : PARP-1… •  protéines stabilisant la chromatine  RNA hélicase A, facteurs de splicing  no transcription  Facteurs d’initiation de traduction eIF2,3,4… « blebbing »

21. Substrats des caspases et signalisation • protéines antiapoptotiques : • kinases : • Bcl-2, BclX-L : antiproapoptotiques • c-FLIP : inhibiteur de la caspase 8 • Bid c-Bid : libération de cytochrome c • virus : leurres Bcl-2 like • Akt et Raf-1 phosphorylent et inactivent Bad • NFK-B : fragment de p65 lie l’ADN mais pas de transactivation • IK-B : fragment n’est plus dégradé par le protéasome • MEKK1 :fragment active d’autres caspases

22. 6. Méthodes de détection de l’apoptose

24. Changements morphologiques control apoptotic • Microscopie photonique : • - condensation de l’ADN, fragmentation nucléaire, corps apoptotiques • Microscopie électronique : • - balayage • - transmission

25. Fragmentation de l’ADN Agarose gel electrophoresis Chromatin Fragmented Chromatin

27. Activation des caspases, changements mitochondriaux • substrats chromogènes spécifiques • anticorps spécifiques : western blot, immunodétection in situ • western-blot cytochrome c : extraits cytosoliques / mitochondriaux • cytométrie

28. Exposition des phosphatidyl-sérines A- control B-spontaneous apoptosis C- actinomycin D D- calcium ionophore Quandrants 1 – viable cells 2 – early apoptosis; PS exposed, intact membrane 3 – late apoptosis; PS exposed, disrupted membrane 4 – necrosis; disrupted & membrane loss 4 3 1 2 Propidium iodide Annexin V-FITC

29. Abréviations : TNF: Tumor Necrosis Factor TRADD: TNF Receptor-Associated Death Domain TRAF2 : TNF Receptor-Associated Factor 2 RIP: Receptor-Interacting Protein SODD: Silencer Of Death Domains FADD: Fas-Associated Death Domain DISC: Death Inducing Signaling Complex TRAIL: TNF Related Apoptosis Inducing Ligand DR: Death Receptor IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein FLICE : FADD Like Interleukin-1bConverting Enzyme (caspase 8) cFLIP: FLICE Inhibitory Protein APAF: Apoptosis Protease Activating Factor BH: Bcl-2 Homology Bcl-2: BCell Lymphoma 2

30. 7. Anoïkis : apoptose par détachement

32. Signaux de survie Cellule 2 Collagène, fibronectine, vitronectine Facteurs de croissance INTEGRINES RTK (ex: TrkB) Cadhérines a b membrane plasmique Cellule 1 Protéines liant l’actine Pinch, Nck2, IRS-1 ? actine ILK FAK Protéines adaptatrices b-caténine PI3K Cytosquelette Akt • Signaux anti-apoptotiques : • Inhibition de Bad, caspase 9 • Transcription d’IAP, bcl-2… • Inhibition de la transcription de FasL, bim…

33. AKT - + - Caspase 9 Bad FoxO YAP JNK/p38 iKB-kinase CREB mdm2 P P P 14.3.3 14.3.3 14.3.3 Bcl-2 E3 Ubiquitine-ligase Dégradation d’IKB séquestrés dans le cytosol Dégradation de p53 Translocation de NFKB NFKB Transcription de gènes pro-apoptotiques FoxO YAP p73 Transcription de gènes anti-apoptotiques FasL, bim… bcl-2, IAP… NOYAU

34. 8. Nouvelles formes d’apoptose 8.1 ETosis

35. Elastase DAPI Histones Elastase Histones

38. 8.1 Eryptosis

40. Anévrisme thrombus F Définitions Anatomique : perte de parallélisme des bords de l’aorte réalisant une masse battante et expansive Physiopathologique : perte de la fonction de contention de l’artère due à une protéolyse progressive de la matrice extracellulaire Changements dégénératifs dans la média F • Elastine Collagène Protéoglycanes • disparition des CML

41. NT T

42. NT T

44. NT T

45. NT T

48. NT media adventice