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欢迎各位专家

欢迎各位专家. 莅临指导. 胶质瘤侵袭性生长与基质金属蛋白酶-2及其抑制物关系的研究. 博 士 研 究 生 李蕴潜 指 导 教 师 索敬贤 教授 王长坤 教授. 吉林大学第一临床学院 神经外科. 前 言. 大量研究表明，尽管近年来胶质瘤的治疗技术不断提高，但并未从根本上显著改善患者总的预后，其中一个重要原因是胶质瘤的侵袭性生长给手术彻底切除带来许多困难

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Presentation Transcript

  1. 欢迎各位专家 莅临指导

  2. 胶质瘤侵袭性生长与基质金属蛋白酶-2及其抑制物关系的研究胶质瘤侵袭性生长与基质金属蛋白酶-2及其抑制物关系的研究 博 士 研 究 生 李蕴潜 指 导 教 师 索敬贤 教授 王长坤 教授 吉林大学第一临床学院 神经外科

  3. 前 言

  4. 大量研究表明，尽管近年来胶质瘤的治疗技术不断提高，但并未从根本上显著改善患者总的预后，其中一个重要原因是胶质瘤的侵袭性生长给手术彻底切除带来许多困难 肿瘤侵袭生长是指瘤细胞突破基底膜和细胞外基质（ECM）构成的组织学屏障，侵犯到邻近的正常组织，并在该处继续生长、增殖的过程

  5. 基底膜和ECM降解是肿瘤侵袭的关键，能降解ECM的蛋白酶有多种 其中基质金属蛋白酶类（MMPs）是与肿瘤的侵袭生长关系十分密切的蛋白水解酶 体内MMPs的表达和活性有多种调节方式，包括转录水平调节、酶原的活化、特异性组织抑制因子的调节等。其中金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）是MMPs的特异性抑制物

  6. 已有研究证明，MMP-2和MMP-9是降解ECM成分的重要蛋白酶 在乳腺癌、食道癌、肺癌等多种癌组织均有这两种酶表达和活性增加 肿瘤的恶性程度与MMP-2、MMP-9表达水平呈正相关 MMP-2／TIMP-2的比值可决定肿瘤恶性程度及预后 这些研究均证明，肿瘤细胞的侵袭能力与MMP-2、MMP-9及TIMP-2的表达和活性有密切联系，其中与MMP-2和TIMP-2的关系更为重要

  7. 然而，与上述肿瘤的研究相比，胶质瘤的侵袭能力与MMPs和TIMPs之间关系的研究很少。有初步研究表明，MMP-2、MMP-9和MT-MMPs与胶质瘤侵袭性的关系更密切，可能是胶质瘤细胞侵袭能力的重要因素。但有关MMP-2和TIMP-2之间的平衡与胶质瘤侵袭性生长的关系尚未阐明，深入的研究很少

  8. 本研究利用临床材料和实验材料进行下述5个方面的研究 通过这些人体和实验材料的研究，目的是探讨胶质瘤侵袭生长行为与MMP-2、TIMP-2表达以及活性的关系，为抑制MMP活性的角度阻止胶质瘤的侵袭性提供科学依据

  9. 实 验 一 胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其 抑制物-2蛋白表达的研究

  10. 材 料 与 方 法 材料 收集1999年至2001年本院神经外科手术切除并经病理确诊的胶质瘤标本35例，男性15例，女性20例，平均年龄40.3岁（10~77岁）。患者术前未使用过抗癌药物。按Kernohan标准进行分级：Ⅰ级7例，Ⅱ级12例，Ⅲ级10例，Ⅳ级6例。另取2例正常脑组织作为对照

  11. 免疫组织化学染色方法和结果判定： 用LSAB法进行人胶质瘤组织MMP-2、TIMP-2和Ki-67的免疫组化染色 ★MMP-2和TIMP-2表达的判定以染色强度和阳性细胞的百分率之和（分值）进行评价 ★Ki-67表达是在网格测试板进行计数，然后计算出Ki-67标记指数（LI）

  12. 结 果 一、MMP-2 的表达 MMP-2阳性染色位于瘤细胞的胞浆。表达MMP-2的阳性细胞多呈散在分布，但一些病例在肿瘤侵润的边缘常常相对集中。随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2蛋白表达阳性的细胞数逐渐增多，染色强度逐渐增强，表达强度也逐渐增加，其中以Ⅳ级胶质瘤MMP-2蛋白表达最高。各组间的阳性表达和表达强度比较均有显著性意义

  13. 不同级别胶质瘤MMP-2表达阳性细胞LSAB 法×400 II I III IV

  14. 表3 胶质瘤MMP-2阳性细胞表达率及表达强度（x±s） 级 别 例 数 阳性表达（%） 表达强度（分值） Ⅰ 7 10.42±3.95 2.14±0.38 Ⅱ 12 29.92±7.69a 3.17±0.71 a Ⅲ 10 45.40±9.01ab 4.00±0.70 ab Ⅳ 6 57.17±11.39abc 5.83±0.41 abc a: 与Ⅰ级比较, p＜0.05; b: 与Ⅱ级比较，p＜0.05; c: 与Ⅲ级比较, p＜0.05

  15. 二、TIMP-2的表达 TIMP-2阳性染色位于瘤细胞的胞浆中。阳性细胞多呈散在性分布。TIMP-2免疫组化显示的情况与MMP-2相反，即随着胶质瘤恶性程度的增加，TIMP-2蛋白表达阳性的细胞数逐渐减少，表达强度也逐渐下降，以Ⅰ级胶质瘤TIMP-2蛋白表达最高，Ⅳ级表达最低。同时，随着胶质瘤恶性程度的增加，MMP-2／TIMP-2的比值也明显升高，各组间比较有统计学意义

  16. 不同级别胶质瘤TIMP-2表达阳性细胞 LSAB 法×400 II I III IV

  17. 表4 胶质瘤TIMP-2阳性细胞表达率、表达强度及MMP- 2/TIMP-2分值的比值（x±s） 级别 例数 阳性表达 表达强度 MMP- 2/TIMP-2 （%） （分值） Ⅰ 7 51.81±12.28 5.57±0.53 0.37±0.11 Ⅱ 12 36.42±9.68a 3.92±0.29a 0.82±0.23 a Ⅲ 10 22.10±7.71ab 2.70±0.50ab 1.52±0.32 ab Ⅳ 6 4.33±1.63abc 2.17±0.41abc 2.92±0.20 abc a: 与Ⅰ级比较, p<0.05; b: 与Ⅱ级比较，p<0.05; c: 与Ⅲ级比较, p<0.05

  18. 相关分析显示，在各级别的胶质瘤中， MMP-2与TIMP-2 的表达强度见图9，它们 之间呈明显负相关（r =－0.69，p<0.05）

  19. MMP-·2 TIMP-2 III II IV 胶质瘤级别 图 9.不同级别胶质瘤MMP-2和TIMP-2 的表达强度

  20. 三、Ki-67表达和Ki-67标记指数（LI） Ki-67阳性表达呈棕黄色颗粒状，定位于细胞核。随着肿瘤恶性程度的增高，Ki-67阳性表达的瘤细胞数逐渐增加。各级别胶质瘤Ki-67阳性表达瘤细胞数的百分数（Ki-67标记指数，LI）之间有统计学意义（p<0.05）（表5）

  21. 不同级别胶质瘤Ki-67表达阳性细胞 LSAB 法×400 I II IV III

  22. 表5 各级别胶质瘤Ki-67标记指数（x±s） 级 别 例 数 标记指数（%） Ⅰ 7 8.57±1.81 Ⅱ 12 15.33±3.80a Ⅲ 10 27.10±5.20ab Ⅳ 6 44.17±8.82abc a: 与Ⅰ级比较, p＜0.05; b: 与Ⅱ级比较，p＜0.05; c: 与Ⅲ级比较, p＜0.05

  23. 实验二 人胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其 抑制物-2基因表达的研究

  24. 材 料: 收集1999年至2001年本院手术切除的胶质瘤标本25例，男性13例，女性12例，平均年龄50.3岁（31~67岁）。患者术前未使用过抗癌药物。按Kernohan标准进行分级：Ⅰ级6例；Ⅱ级8例；Ⅲ级6例；Ⅳ级5例。手术中无菌条件下切取少量脑胶质瘤的实质部分，迅速置于液氮中冷冻。另取2例正常脑组织作为对照

  25. 方 法： 用逆转录PCR的方法检测各组病例脑组织的MMP-2和TIMP-2 mRNA表达水平（具体步骤和cDNA引物从略） 利用凝胶成像处理系统对每一样品PCR产物扩增的特异性片断（MMP-2、TIMP-2和β-actin）进行密度扫描，以β-actin密度作为参考定量标准，MMP-2及TIMP-2和β-actin密度比值作为定量结果

  26. 结 果 正常脑组织MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达水平均较低。在各级别胶质瘤中均有MMP-2mRNA表达，但表达水平与其级别有关，恶性程度越高，其表达水平越高 在各级别胶质瘤中TIMP-2 mRNA均有表达，级别低的胶质瘤TIMP-2 mRNA表达较高，而恶性程度高者TIMP-2 mRNA表达水平反而降低。各组之间MMP-2/TIMP-2基因表达的比值具有显著意义

  27. M C I II III IV 图14.不同级别胶质MMP-2 mRNA表达 C:正常脑组织, Ⅰ-Ⅳ:Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤

  28. M C I II III IV 图15不同级别胶质瘤TIMP-2 mRNA表达C:正常脑组织, Ⅰ-Ⅳ:Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤

  29. 表6 胶质瘤MMP-2和TIMP-2 mRNA 的表达及二者比值(x±s) 级别 例数MMP-2 TIMP-2 MMP-2/ TIMP-2 Ⅰ 6 0.49±0.06 1.95±0.22 0.23±0.02 Ⅱ 8 0.75±0.07a 1.31±0.14a 0.57±0.04 a Ⅲ 6 1.21±0.12ab 0.69±0.05ab 1.75±0.18 ab Ⅳ 5 1.66±0.21abc 0.38±0.02abc 4.37±0.79 abc a: 与Ⅰ级比较, p＜0.05; b: 与Ⅱ级比较，p＜ 0.05; c: 与Ⅲ级比较, p＜0.05

  30. 实验三 胶质瘤基质金属蛋白酶-2及其 抑制物-2活性的研究

  31. 胶质瘤标本来源、病理确诊、分级标准、标本切除、处理方法及对照标本均同实验二 用酶谱法和反向酶谱法分别检测MMP-2和TIMP-2活性 对电泳条带进行灰度扫描，用酶解量表示酶的活性 条带的酶解量 = 条带面积×(条带灰度－背景灰度） 每个样品设两个平行样本，并经 3 次重复实验，每次实验均设同一参照

  32. 结 果 用酶谱法检测MMPs 活性，结果表现为在蓝色凝胶背景上出现无色透明条带。本实验在凝胶上的透明条带分子量为62kD，根据分子量及底物（明胶）特异性，62kD为MMP-2的活化形式。随着肿瘤恶性程度的增加，MMP-2活性也明显增加，而TIMP-2的活性则与MMP-2相反，即随着肿瘤恶性程度的增加，TIMP-2活性明显降低

  33. 表7 不同级别胶质瘤MMP-2和TIMP-2活性（x±s） 级 别 例 数 MMP-2活性 TIMP-2活性 Ⅰ 6 1.66±0.59 3.45±1.58 Ⅱ 8 2.15±0.68a 2.29±1.14a Ⅲ 6 3.21±1.21ab 1.18±0.35ab Ⅳ 5 4.11±1.65abc 0.68±0.12abc a: 与Ⅰ级比较, p＜0.05; b: 与Ⅱ级比较，p＜0.05; c: 与Ⅲ级比较, p<0.05

  34. C Ⅱ Ⅳ III Ⅰ c IV 图17 不同级别胶质瘤MMP-2活性 C：正常脑组织；Ⅰ-Ⅳ：Ⅰ-Ⅳ级胶质瘤

  35. 实验四 胶质瘤细胞株体外侵袭能力的研究

  36. 本实验的基本原理是： 将含有基质成分的Matrigel基底膜胶铺在多微孔的滤膜上，使在体外形成人工基底膜。在膜的下室加入趋化因子，加入到上室腔的肿瘤细胞，受到滤膜下面趋化因子的趋化作用而向下运动，当分泌的蛋白酶降解了覆盖膜孔的Matrigel后，才能运动到膜的下室面。计数膜下室面的细胞可定量反映肿瘤细胞的侵袭能力

  37. 材料： 1.Boyden小室，由多伦多大学Kalinski教授惠赠 2.聚碳酸酯多孔滤膜（PVPF滤膜），孔径8μm 3.Matrigel基底膜胶, 主要为基底膜成分 4.抗MMP-2抗体，博士德公司产品 5.NIH 3T3细胞和U87MG恶性胶质瘤细胞株，由多伦多大学Kalinski教授惠赠

  38. 方法： 1.用NIH 3T3细胞制备含趋化因子的条件培养液，作为趋化因子的来源 2.在PVPF滤膜上室面铺Matrigel胶 3.在小室的下室腔加上述含趋化因子的培养液和DMEM培养液 4.将PVPF滤膜置于下室腔的培养液上，旋紧顶盖以固定滤膜

  39. 5. 在小室的上室腔内分别加入: 保温1h的U87MG恶性胶质瘤细胞（2×105） U87MG胶质瘤细胞+抗MMP-2抗体（对抗MMP-2） U87MG胶质瘤细胞+EDTA（抑制MMP-2活性） 每组设3个平行样本

  40. 6. 将侵袭小室置于CO2培养箱内孵育6h后终止孵育 7. 用棉签彻底擦去滤膜上室面的细胞，拧下顶盖，取出滤膜，甲醇固定，HE染色，封固 8. 将滤膜人为分为相等的9个区，每个滤膜在400倍光镜下计数除四角以外的5个区的肿瘤细胞数，计算平均值

  41. 结 果 表8 恶性胶质瘤细胞体外穿膜的细胞数（x±s） 分 组 孵育时间（h） 穿膜细胞数 抑制率(%) U87MG 6 231±72 U87MG+EDTA 6 48±17a 381.0 U87MG+MMP-2抗体 6 53±20a 335.8 a: 与U87MG组比较，p< 0.01

  42. 实验五 胶质瘤细胞株对胶原降解 能力的研究

  43. 材料: Ⅳ型胶原酶 明胶（gelatin） 纤维蛋白溶酶 琼脂糖等

  44. 方法： 1.将U25MG胶质瘤细胞在DMEM培养液培养3d后，收集该胶质瘤条件培养液，浓缩，-80℃保存备用 2.配制2% 琼脂糖溶液

  45. 3.将琼脂糖和明胶溶液以1:1的比例混合，将混合液加至培养皿，凝固后，用打孔器打孔，孔间距离1.5cm以上3.将琼脂糖和明胶溶液以1:1的比例混合，将混合液加至培养皿，凝固后，用打孔器打孔，孔间距离1.5cm以上 4.将胶质瘤细胞条件培养液加入不同孔中。同时每孔加入一定量纤维蛋白溶酶（刺激酶原形式MMP活化）。培养板皿在37℃温育24h

  46. 5. 设单独加抗MMP-2抗体及单独加EDTA阴性对照孔和胶原酶阳性对照孔。每个条件设3个复孔 6. 温育后取出凝胶片，用考马斯亮蓝R250染色并脱色 7. 分别测量孔周围呈无色透明空斑的面积

  47. 结 果 表9 胶质瘤细胞对胶原降解能力的研究（x±s） 分 组 孵育时间（h）空斑面积（mm2）抑制率（%） U87MG 24 107.55±21.75 U87MG+EDTA 24 22.51±4.95 a 377.79 U87MG+MMP-2抗体 24 30.76±9.88 a 249.64 a: 与U87MG组比较，p<0.01

  48. 讨 论

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