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茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究

茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究. 答辩人：朱磊 专业：微生物学 导师：刘波 研究员. 主要内容. 一．前言 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 三．番茄尖孢镰刀菌 GFP 转化体系的优化 四．番茄尖孢镰刀菌 GFP 转化子的生物学特性 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 六．番茄尖孢镰刀菌在土壤中的定殖特性 七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 八．结论与展望. 一．前言. Fusarium oxysporum Schl. 健康田块. 发病田块.

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茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究

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Presentation Transcript

  1. 茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究茄科尖孢镰刀菌绿色荧光蛋白基因转化体系的优化及其定殖特性的研究 答辩人：朱磊 专业：微生物学 导师：刘波 研究员

  2. 主要内容 一．前言 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 三．番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 六．番茄尖孢镰刀菌在土壤中的定殖特性 七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 八．结论与展望

  3. 一．前言 Fusarium oxysporum Schl. 健康田块 发病田块 茄科 （Solanaceae），分布于热带和温带地区。茄属Solanum、烟草属Nico-tiana、辣椒属Capsicum、番茄属Lyco-persicum、枸 杞属Lycium等都很有经济价值。 尖孢镰刀菌属半知菌类（Fungiimperfecti） 、 梗孢目（Moniliales） 、痤孢科（Tubercular） 、 镰刀菌属（Fusarium）。

  4. 一．前言 • GFP及其在丝状真菌中的研究概况 • GFP这一新型报告基因，优点： （1）荧光稳定 （2）GFP对受体细胞无毒害 （3）通用性 （4）无假阳性干扰 （5）检测便捷 • GFP已广泛运用在各种丝状真菌的分子生物学研究 核盘菌属、木霉属、球腔菌属、疫霉属、镰刀菌属等。

  5. 一．前言 GFP转导 致病机理 生物防治 致病菌（FJAT-282） 侵染机制 标记菌株 微生态群落结构

  6. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 • 材料与方法 植株及根际土的采集（不同地区、不同寄主等） DNA提取

  7. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 • 枯萎病危害调查及其发病症状 • 成株期、开花结果期 • 温度25 ℃-28 ℃，土壤潮湿 • 叶片似缺水萎焉，早晚尚能恢复 • 全株叶片枯萎，维管束变深褐色， 早晚不能恢复，直至死亡

  8. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 白色、淡紫色，棉絮状。4 d：直径43.3±2 mm 小型分生孢子：椭圆形或卵圆形；17.6（9.5-23.9）×2.5（2.0-3.0）μm 大型分生孢子：镰刀型或纺锤型；3个隔膜；25.7（17.5-33.5）× 2.5（2.1-3.5）μm Booth（1971）：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum ） • 病原菌的分离与鉴定

  9. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 FU3/FU4 516 bp 1000 bp 500 bp Fu3 ： 5’ -CCG AGT TTA CAA CTC CCA AA-3’ ; Fu4 ： 5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ FOF1/FOR1 340 bp 1000 bp 500 bp • 病原菌的分子鉴定 FOF1：5′-ACA TAC CAC TTG TTGCCT CG-3′ ; FOR1：5′-CGC CAA TCA ATT TGAGGA ACG-3′

  10. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 ITS4/ITS5 600-700 bp 1000 bp 500 bp ITS4：5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3' ITS5：5'-GGAAGT AAAAGTCGTAAC AAGG-3' • 真菌ITS区测序分析 • ITS4/ITS5

  11. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 2株 3株 35株 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum ）：87.5 % 优势菌群 • 病原菌的分子鉴定

  12. 二．茄科作物枯萎病原的分离及鉴定 CK 9100 • 致病性测定 • 接种病原物10 d-2周 • 发病率:80% -100% • 症状：叶缘黄化萎焉、根部褐变、 维管束组织褐变

  13. 三 ．番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化 转化子（HmB 200 ug/mL） 酶解 原生质体 • 材料与方法 质粒PCT74，强组成型表达sGFP的载体，采用真菌Pyrenophora tritici-repentis的ToxA启动子，同时具有潮霉素B磷酸转移酶基因。

  14. 三 ．番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化 原生质体 初生转化子 原生质体制备: 20 mg/ml Drease，20 mg/ml 融壁酶，酶解消化3 h • 原生质体的制备及gfp基因的转化

  15. 三 ．番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化 分生孢子 菌丝 • 原生质体的制备及gfp基因的转化（荧光观察）

  16. 三 ．番茄尖孢镰刀菌GFP转化体系的优化 继代培养6代 -无选择压力 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1为原始菌株282； 2-9号代表转化子； 10为阳性对照； 11为阴性对照 417 bp • 转化子的稳定性筛选 P28，5/TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT3/ P29，5/GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT3/

  17. 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 生长速度 外源基因 菌体形态 转化子 生物学特性 PH值对菌株的影响 对抗生素的耐受力 • 材料与方法

  18. 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 • 转化子的生长速度、菌体形态

  19. 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 282 3601 3606 3609 282 3612 3614 • 转化子的生长速度、菌体形态

  20. 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 生长速度（CM） 菌株编号 • 不同PH对转化子生长的影响

  21. 四．番茄尖孢镰刀菌GFP转化子的生物学特性 0 100 200 300 400 HmB浓度（0，100，200，300，400 ug/mL） • 转化子对潮霉素的抗性水平测定

  22. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 番茄282-GFP（FJAT-3993） 孢子浓度107/mL CLSM扫描 徒手切片 • 材料与方法

  23. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 1 2 3 侧根 须根 茎部 • 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）跟踪观察GFP菌株在植株体内的侵染症状观察 1代表对照 2、3代表处理植株

  24. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light • 利用激光共聚焦显微镜跟踪观察GFP菌株在植株体内侵染情况 -第3 d，根表皮

  25. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light • 利用激光共聚焦显微镜跟踪观察GFP菌株在植株体内侵染情况 -第6 d，根表皮、根毛区韧皮部

  26. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light • 利用激光共聚焦显微镜跟踪观察GFP菌株在植株体内侵染情况 -第10 d，根部、茎基部

  27. 五．番茄尖孢镰刀菌在植株体内的侵染定殖 A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light A：UV light； B ：white light； C：UV combined with white-light • 利用激光共聚焦显微镜跟踪观察GFP菌株在植株体内侵染情况 -第17 d，侧根、茎基部

  28. 六．番茄尖孢镰刀菌土壤中的定殖特性 FJAT-3993 • 材料与方法 菌液与土壤混匀 定时、定量取样检测（处理前，第 2、4、8、16、32天检测） PLFAs（微生物群落结构） 定殖特性

  29. 六．番茄尖孢镰刀菌土壤中的定殖特性 • 镰刀菌的分离

  30. 六．番茄尖孢镰刀菌土壤中的定殖特性 • GFP菌株在不同土壤中的消长动态 表1 FJAT-3993菌株在不同土壤中定殖动态

  31. 六．番茄尖孢镰刀菌土壤中的定殖特性 • GFP菌株在不同土壤中的消长动态

  32. 六．番茄尖孢镰刀菌土壤中的定殖特性 2d 4d 32d 8d 16d • 不同土壤中转GFP基因菌株的荧光观察

  33. 七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 沙土 水稻土 FJAT-3993 菜园土 泥潭土 脂 肪 酸 测 定 甲 酯 化 中 和PH 萃 取 转 移 样本 • 材料与方法

  34. 七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 沙土 菜园土 水稻土 泥潭土 • PLFAs法分析转化后菌株对土壤微生物群落结构的影响 • FJAT-3993对土壤中脂肪酸生物标记总量和种类的影响

  35. 七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响七．番茄尖孢镰刀菌对土壤微生物群落结构的影响 沙土 菜园土 水稻土 泥潭土 • FJAT-3993对土壤真菌、细菌及放线菌特征性脂肪酸标记的影响

  36. 八 ．结论与展望 • 采集分离了茄科作物发病地区的植株及根际土的内生真菌，经鉴定为镰刀菌属真菌引起，其中优势菌群为尖孢镰刀菌。 • 采用CaC12-PEG介导的方法成功构建了茄科尖孢镰刀菌的GFP转化体系，对转化子的生物学特性进行了分析。荧光稳定性研究表明，其荧光稳定强烈，有利于后续研究。 • 运用CLSM对番茄植株进行光学切片，揭示了标记菌株在植株体内的侵染定殖路线。 • 标记菌株可以在不同性质的土壤中很好的定殖。PLFAs分析表明，标记菌株对各土壤脂肪酸生物标记总量影响各不相同，但种类上都呈增长态势，且各土壤的细菌特征性脂肪酸都占绝对优势。 • 利用CLSM对标记菌株对植物细胞组织学的研究值得进一步深入研究。 • 引入的异源菌株能否使植株对病原菌的侵染产生抗性及对植株酶活的影响都需要继续做深入的研究。

  37. 致谢 • 感谢我的导师刘波研究员对我的精心指导，三年来使我学到了很多宝贵的专业知识与实验技能，终生受用。 • 感谢福建省农业科学院农业生物资源研究所肖荣凤老师对我的严格要求，以及对我论文的耐心指导及在实验等方面给予的无私帮助。 • 感谢实验室各位老师在实验、生活等方面热心帮助。 • 感谢我的家人、朋友三年来在背后对我的支持。

  38. 谢谢各位评委老师!

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