ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА ПРИ ПАТОЛОГИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА

1. ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕНОМА ПРИ ПАТОЛОГИИ ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕКА Параметры генетического здоровья работников Сибирского химического комбината, жителей г. Северска и Томской области к.б.н. И.Н.Лебедев к.б.н. И.Н. Лебедев, зав. лабораторией цитогенетики ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск

2. Биологические последствия влияния ионизирующего излучения на человека Соматические поражение соматических клеток Генетические поражение половых клеток Ранние (Острые) Ранние (Острые) Отдаленные Отдаленные Гибель потомства, ВПР Лучевой канцерогенез Лучевая болезнь Канцерогенез Местныелучевыепоражения Лучевое старение Нарушение фертильности Физиологическая неполноценность потомства

3. Исследования ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН по проблемам генетического здоровья работников Сибирского химического комбината и населения прилегающих территорий 1) 1996-2000 гг. «Сравнительный анализ параметров генетического здоровья жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области». 2) 2002-2004 гг. «Генетическое здоровье работников СХК, профессионально контактирующих с плутонием-239, и членов их семей». 3) 2006-2009 гг. «Комплексный анализ структурно-функциональных изменений генома при комбинированном воздействии факторов радиационной и химической природы у работников СХК». Назаренко С.А., Попова Н.А., Назаренко Л.П., Пузырёв В.П. Ядерно-химическое производство и генетическое здоровье // Томск: Печатная мануфактура, 2004. – 272 с.

4. Уровни исследований генетических эффектов ионизирующего облучения 1. Популяционный. Исследование частоты врожденных пороков развития и груза наследственной патологии. 2.Молекулярный. Оценка частоты мутаций повторяющихся последовательностей ДНК, возникающих в половых клетках. 3.Клеточный. Цитогенетический анализчисловых и структурных хромосомных нарушений.

5. Популяционный уровень: Анализ частоты врожденных пороков развития Три способа регистрации ВПР: 1. Регистрация у новорожденных 9 «легко» диагностируемых форм ВПР – анэнцефалия, спинномозговая грыжа, расщелины губы и неба, полидактилия, редукционные пороки конечностей, атрезия пищевода, атрезия ануса, синдром Дауна и множественные врожденные пороки развития (МВПР). 2. Стандартизованная система регистрации у детей в возрасте до 1 года 19форм ВПР по правилам Европейского международного регистра EUROCAT. 3. Выявление у детей в возрасте до 1 года всех форм ВПР. За период с 1972 по 1998 гг. в г. Северске было проанализировано 37.394 истории родов и развития новорожденных, а также 2.700 протоколов анатомических вскрытий.

6. Частоты 9 «легко» диагностируемых форм ВПР у новорожденных детей в городских популяциях бывшего СССР Примечание : 1 – Назаренко С.А. с соавт., 2004; 2 - Назаренко Л.П., 1998; 3 - Иванов с соавт., 1997; 4 - Лурье, 1984; 5 - Каюпова, Куандыков, 1990.

7. Динамика частот 9 «легко» диагностируемых форм ВПР (1:1000) у новорожденных г. Северска за три периода наблюдений

8. Средняя частота 19 форм ВПР (1:1000) у детей в возрасте до 1 года в России и по данным европейского регистра EUROCAT

9. Частота всех форм ВПР у новорожденных в г. Северска, Томска в сравнении с некоторыми городскими популяциями России (1:1000 новорожденных)

10. Динамикаотдельных форм и общей частоты ВПР у новорожденных г. Северска с 1972 по 1998 гг. 1. Частота 9 форм ВПР, в этиологии которых наибольший удельный вес занимает мутационная компонента, в течение 27-летнего периода наблюдения, т.е. на протяжении жизни одного поколения, не изменилась. 2. При регистрации 19 форм ВПР в г. Северске до 1993 г. и после обнаружено достоверное повышение их суммарной частоты с 11,96‰ до 18,65‰ (p<0,001), преимущественно за счет пороков сердца. 3. За исследуемый период обнаружено статистически достоверное повышение частоты аномалий развития сердечно-сосудистой и костно-мышечной систем, а также половых органов, при одновременном снижении частот незаращения губы и дисгенезии почек. Рост отмечен по тем формам ВПР, диагностика которых прогрессивно улучшается, в том числе и в дородовый период.

11. Популяционный уровень: Оценка груза наследственной патологии За период обследования в г. Северске было выявлено 114 семей со 138 больными с моногенными наследственными заболеваниями Вывод: Уровень генетического груза в популяциях г. Северска и Томска сопоставим с другими популяциями России, проживающими на не загрязненных радионуклидами территориях.

12. Молекулярный уровень: Анализ частоты гаметических мутаций повторяющихся последовательностей ДНК а б М М 217 256 213 252 248 209 205 236 201 232 197 228 224 Гаметические мутации повторяющихся последовательностей ДНК а) D11S1304 (материнского происхождения), б) D11S1983 (отцовского происхождения), М – маркер молекулярного веса.

13. Частота гаметических мутацийповторяющихся последовательностей ДНК в семьях работников СХК с внешним гамма-облучением • 60 семей работников СХК, получивших на момент рождения ребенка интеграль-ную дозу внешнего гамма-облучения от 1,5 до 137 бэр. Контрольная выборка из 31 семьи, проживающей в поселке Каргала. • В семьях работников СХК средняя частота мутаций составила 0,035 на локус на гамету на поколение, а в контрольных - 0,025. Достоверных различий между группами не обнаружено.

14. Мутации отцовского и материнского происхождения Полученные результаты свидетельствуют о справедливости гипотезы репликационного происхождения значительной части мутаций минисателлитных локусов генома.

15. Частота гаметических мутацийповторяющихся последовательностей ДНК в семьях работников СХК с инкорпорированным плутонием

16. Клеточный уровень: Исследование частоты и спектра хромосомных нарушений Повреждение веретена клеточного деления РазрывывДНК Структурные хромосомные аберрации Числовые хромосомные нарушения: анеуплоидия, полиплоидия

17. Структура и объем исследованного цитогенетического материала в отношении эффектов γ-облучения • * - Реконструированная доза по спектрометрии эмали зубов (Федосеев, Смиренная, 1996); Материалсобранв период1996-1999 гг.

18. Процент аберрантных метафаз у работников СХК с внешним -облучением, жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области * % * * *- p < 0,05 - по сравнению с контролем (критерий Манна-Уитни)

19. Двухударные хромосомные аберрации - дицентрические и кольцевые хромосомы (маркеры радиационного воздействия)

20. Частота дицентрических и кольцевых хромосом (маркеров радиационного воздействия) у работников СХК, жителей г.Северска и прилегающих территорий Томской области * % Спонтанная частота *- p < 0,05

21. Структурныехромосомныенарушенияу жителей г. Северска А Б В Г А - одиночныйразрыв Б - парныйразрыв В, Г - хроматидныеобмены (маркеры химического мутагенеза)

22. Частота хроматидных обменов (маркеров химического мутагенеза) у работников СХК, жителей г.Северска и прилегающих территорий Томской области * Вывод: Общая частота хромосомных аберраций у работников СХК и жителей г.Северска повышена за счет аберраций хроматидного типа – маркеров химического мутагенеза. * * *- p < 0,05

23. Среднее число СХО на клетку у работников СХК, жителей г. Северска и прилегающих территорий * - р<0,05

24. Мультиаберрантные клетки

25. Частота мультиаберрантных клеток у работников СХК, жителей г. Северска и прилегающих территорий Томской области ** *- p < 0,05 **- p < 0,01 * * * Спонтанная частота мультиаберрантных клеток составляет 0,01 на 100 клеток, т.е. 1:10.000 метафаз (Neel et al., 1992; Bochkov, Katosova, 1994).

26. МежиндивидуальнаявариабельностьработниковМежиндивидуальнаявариабельностьработников СХК по частоте хромосомных нарушений 1. У работников СХК, подвергающихся в процессе производственной деятельности облучению сходными дозами ионизирующей радиации, обнаружена высокая межиндивидуальная вариабельность частоты хромосомных аберраций. 2. К категории лиц высокого генетического риска (частота хромосомных нарушений в 4 и более раз превышает спонтанный уровень) отнесено около 25% обследованных индивидов. 3. К категории лиц сверхвысокого генетического риска (превышение частоты спонтанного уровня в 10 и более раз) отнесено 8,5% работников. Вывод: Необходим постоянный цитогенетический мониторинг за состоянием хромосомного аппарата работников ядерно-химического производства с целью своевременного выявления групп повышенного генетического риска и дальнейшей профилактики заболеваний, особенно онкологической патологии.

27. Структура и объем исследованного цитогенетического материалау работников СХК, имеющих внутреннее облучение плутонием-239 Обследование проведено в 2002-2004 гг.

28. Хромосомные аберрации в клетках работников СХК с инкорпорированным плутонием-239 а) Дицентрическая хромосома б) Дицентрическая хромосома с парным фрагментом ПФ DMs DMs DMs Д DMs в) Хроматидный обмен г) Мультиаберрантная клетка

29. Двойные минихромосомы (double minutes) в клетках крови у работников СХК с инкорпорированным плутонием-239 Двойные минихромосомы являются амплифицированными онкогенами. Обычно выявляются только в опухолевых клетках. Маркер начального этапа малигнизации?

30. Частота мультиаберрантных клеток у индивидов с различным содержанием плутония-239 в организме * - p < 0,01

31. Структура и частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у работников плутониевого производства и в контрольной группе (данные 2002-2004 гг.) * - p < 0,01; ** - p < 0,05

32. Структура и частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови у работников плутониевого производства и в контрольной группе (данные 2006-2008 гг.) * p=0,02; ** p=0,002

33. Механизмы действияионизирующейрадиации на генетический аппарат клетки По Mateuca R. et al., 2006

34. Анеуплоидия состояние, при котором число хромосом вклетке не кратно нормальному основному(гаплоидному) набору.

35. Анеуплоидия у человека: • Ранняя гибель эмбрионов и невынашивание беременности. • Множественные врожденные пороки развития. • Наследственные синдромы, сопровождающиеся умственной и физической отсталостью. • Онкопатология.

36. Больше века назад предположил, что рак вызывается анеуплоидией, так как она «формирует патологический фенотип у морских ежей». Теодор Бовери (1867-1915) немецкий цитолог и эмбриолог Петер Дьюсберг, профессор молекулярной и клеточной биологии Калифорнийского университета, Беркли. Дал «анеуплоидной» гипотезе Бовери новое направление в объяснении этиологии и прогрессии рака.

37. Мутагенная индукция анеуплоидии • Агенты, которые индуцируют анеуплоидию при воздействии in vitro и/или in vivo, известны как анеугены или анеуплоидогены; • Анеуплоидия не индуцируется каким-либо одним общим механизмом, а возникает в результате ошибок сегрегации хроматид при делении клетки; • При облучении может происходить радиационный лизис белков, содержащих SH- и S-S-группы, что ведет к фрагментации пептидных цепей.

38. Гиперплоидия • избыток одной или нескольких • хромосом набора возникает в результате нерасхождения хромосом при делении клетки Гипоплоидия • недостаток одной или нескольких • хромосом набора возникает как в результате нерасхождения, так и отставания хромосом или хроматид в ходе клеточного деления

39. Схемахромосомногонерасхождения Трисомия Моносомия

40. Схема хромосомного отставания Моносомия Микроядро Моносомия

41. Принцип флюоресцентной гибридизации in situ

42. Интерфазная цитогенетика Нормальные клетки с дисомией11и 16 Трисомия 12 Моносомия 7 Дисомия Y Нуллисомия Х Тетраплоидия

43. 3 52% р=0,01 2,5 23% р=0,25 2 1,5 1 0,5 0 Контроль Работники СХК -Некультивированные лейкоциты - Культивированные лейкоциты (1 цикл репликации ДНК) Суммарная частота анеуплоидии у контрольных лиц и работников СХК с внешним гамма-облучением внекультивированных и культивированных клетках Назаренко С.А., Тимошевский В.А. Сравнительный анализ частоты анеуплоидии в покоящихся и делящихся клетках человека при воздействии вредных внешнесредовых факторов // Генетика. 2005. Т. 41. № 3. С. 391-395. 

44. Тест-система определения мутагенного влияния Обнаруженные закономерности могут быть положены в основу нового способа оценки мутагенного потенциала различных физических, химических и биологических факторов на основе технологии интерфазного молекулярно-цитогенетического анализа. Тимошевский В.А., Лебедев И.Н., Назаренко С.А.Биологическая индикация мутагенных воздействий: анализ числовых хромосомных нарушений в интерфазных клетках человека // Томск. 2006 г. 40 с.

45. Тест-система определения мутагенного влияния Отсутствие вредного воздействия Мутагенное влияние Некультивированные и культивированные клетки Значимое повышение Незначимоеповышение Разность в частоте числовых хромосомных нарушений Преимущество тест-системы: индивидуализация оценки мутагенного воздействия.

46. Анализ цитокинез-блокированных двухъядерных клеток Цитохалазин В

47. Схема определения хромосомного отставания и нерасхождения с помощью FISH-анализа двухъядерных клеток А cen FISH Б А: двухъядерная клетка с микроядром, содержащим центромерный FISH-сигнал, принадлежащий отставшей хромосоме; Б: распределение гибридизационных сигналов в ядрах при хромосомном нерасхождении.

48. Характеристика обследуемых групп

49. FISH-анализ цитокинез-блокированных двухъядерных клеток - D7Z1 - D7Z1 - D12Z3 - D12Z3 Нормальные двухъядерные лимфоциты Двухъядерные лимфоциты, в которых произошло нерасхождение хромосомы 12

50. Частота нерасхождения по хромосомам 2, 8, 7, 12 в цитохалазин-блокированных лимфоцитах СХК СХК p=0,037 p=0,023 контроль контроль СХК СХК p=0,008 P<0,001 контроль контроль