Rozpraszanie światła

1. Rozpraszanie światła

2. Światło • fala elektromagnetyczna o długości z zakresu widzialnego (400-700nm) • strumień fotonów

3. Natura falowa światła • Ez(t)=Eosin(2πυt-ky) • Hx(t)=Hosin(2πυt-ky) • Eo,Ho - amplitudy • υ - częstotliwość • k=(2π/λ)=ω/c - wektor falowy w kierunku rozchodzenia się fali • ω=2πυ=2πc/ λ - częstość kątowa

4. Natura falowa światła • w liczbach: prędkość światła c=2,9979×108m/s długość fali λ=(390 - 780)nm (nm = 10-9m = 10Å) częstotliwość υ = (7,7 - 3,8)×1014 Hz (fioletowe-czerwone) liczba falowa (częstość υ =1/λ) 25000-13000 cm-1 rozmiar cząsteczek rozpraszających: 10-100Å (1-10 nm)

5. Natura korpuskularna światła • promieniowanie EM jest strumieniem fotonów • E=hν=hνc, energia fotonu o częstotliwości ν Hemoglobina ma kolor czerwony! - silnie absorbuje promieniowanie żółte, zielone i niebieskie a przepuszcza czerwone Zaabsorbowany foton odpowiadający światłu żółtemu (λ=550nm) to energia 3,61×10-19J

6. Rozpraszanie światła • http://www.wyatt.com/theory/ Prawo elektrodynamiki klasycznej: drgający ładunek jest źródłempromieniowania rozchodzącego się we wszystkich kierunkach w płaszczyźnie prostopadłej do oscylacji Cechy: częstość i intensywność

7. Cechy promieniowania rozproszonego • Intensywność (natężenie), I I~ Eo2 (kwadrat amplitudy pola elektrycznego) I~λ-4 (fale krótsze rozpraszają się silniej niż dłuższe) I zależy od kąta rozpraszania θ • Częstość: • równa częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Rayleigha (1871r.) = elastyczne • różna od częstości promieniowania padającego = rozpraszanie Ramana (1928r.) = nieelastyczne

8. Dlaczego niebo jest niebieskie?

9. Dlaczego niebo jest niebieskie! I ~ 1/4 (700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

10. Dlaczego niebo jest niebieskie! I ~ 1/4 (700 nm / 400 nm)4 = 1.754 = 9.4 Światło czerwone rozprasza się nawet 9-krotnie słabiej niż fioletowe.

11. Rozpraszanie w roztworze v-mikroskopijnie mały element objętości zawierający molekuły rozpraszające światło, ki , ks – wektory falowe światła padającego i rozproszonego. q- wektor rozpraszania, P- punkt obserwacji natężenia pola elektrycznego Es, odległy o R od środka układu rozpraszającego, W elastycznym rozpraszaniu światła, ki i ks są sobie równe, |q| = |ki ­ ks| = 2n/sin().

12. Częstotliwość światła rozproszonego • Częstotliwość: • równa częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Rayleigha) = elastyczne oddziaływanie pola fali EM z dipolem elektrycznym cząsteczki • różna od częstotliwości promieniowania padającego = (rozpraszanie Ramana) = nieelastyczne oddziaływanie- zmiana stanu energetycznego atomu lub cząsteczki !!Ale zmiana częstotliwość może wyniknąć z ruch cząsteczek rozpraszających - efekt Doplera

13. Zmiana częstotliwości

14. Widmo światła rozproszonego

15. Fluktuacje natężenia

16. Wielkość mierzona - rodzaj eksperymentu • Natężenie całkowite (rozpraszanie statyczne) – SLS(Statyczne Rozpraszanie Światła) • Widmo światła rozproszonego (Interferometria Fabry-Perota) • Fluktuacje natężenia światła rozproszonego DLS lub PCS(Dynamiczne Rozpraszanie Światła lub Spektroskopia Korelacji Fotonów)

17. Układ pomiarowy próbka λ, Ii laser θ I Ist - standard (benzen, toluen) detektor Io - rozpuszczalnik (buffor) I - roztwór (białka, DNA, etc.) q =  2n/sin()

18. Układ pomiarowy

20. Rozpraszanie promieniowania Natężenie promieniowania rozproszonego I(q): gdzie: RΘ jest współczynnikiem Rayleigha q - wektor rozpraszania, K - stała zależna od przyrządu oraz kontrastu optycznego dn/dc, c - stężenie wagowe, M - masa cząsteczkowa (wagowo średnia), P(q) - czynnik kształtu (interferencja wewnątrzcząsteczkowa), S(q) - czynnik struktury (interferencja międzycząsteczkowa)

21. Rozpraszanie statyczne w roztworze Kc/R siła jonowa 1/M c P(q)  1 (interferencje wewnątrzcząsteczkowe) S(q)  interferencje międzycząsteczkowe

22. Indykatrysy rozpraszania światła – I(θ)  P(q) Dla cząsteczek małych w porównaniu z długością fali światła: d <<  Dla cząsteczek porównywalnych z długością fali światła: d  

23. Rozpraszanie statyczne w roztworze I(θ)  P(q) 1/I a q2 tg  = 1/3 q2Rg2 P(q)  interferencje wewnątrzcząsteczkowe ~Rg

24. Wymiary: R = 10 nm R = 17.7 nm, h = 1 nm L=333 nm, d = 20 nm

25. g(t) g(t) widmo w w I I natężenie t t funkcja korelacji t t Rozpraszanie dynamiczne światło rozproszone światło lasera

27. Spektroskopia Korelacji Fotonów(Photon Correlation Spectroscopy - PCS) • Zastosowanie do badań submikrosopowych obiektów biologicznych. • Co można zmierzyć: • Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT): • makrocząsteczek biologicznych (białka, kwasy nukleinowe), • biologicznych układów supramolekularnych (organella komórkowe, pęcherzyki utworzone z błony lipidowej, asocjaty białkowe, mniejsze komórki) G(t) = <I(0)I(t)> g(2)(t) = 1 + exp(-2 q2DT).

28. Informacje z pomiaru spektroskopii korelacji fotonów (PCS) • Pomiar DT- informacje o rozmiarze i kształcie obiektu rozpraszającego • kula • elipsoida obrotowa • pałeczka • „model kulkowy” DT = kBT/(6RH)

29. Spektroskopia Korelacji Fotonów • Z zależności DT od stężenia otrzymuje się informacje o sile i naturze oddziaływań między obiektami. DT odpychanie kompensacja przyciąganie c

30. Vh = Vo= VH2O (objętość hydratowanego białka) Vo = (Mw/NA)v2 (objętość „suchego” białka) VH2O = δ1 (Mw/NA)v1 (objętość dołączonej wody) Kombinacja RH z v2i δ1v1 Rh =  [(3/4π)Vh]1/3 = [(3/4π)(Mw/NA)(v2 + δ1v1)]1/3 Vh = (Mw/NA)(v2 + δ1v1) v2 - objętość właściwa cząsteczki, dla białek 0.69-0.75 (cm3/g), średnio 0.73 (cm3/g) [na podstawie sekwencji] δ1- hydratacja, dla białek 0.2-0.6 (g H2O/g białka), średnio 0.35(g H2O/g białka) [na podstawie sekwencji] v1– objętość właściwa wody związanej z makrocząsteczką, v1 = 0.9058(cm3/g) RH = Rh F

31. Lizozym - model elipsoidy

32. d L Może się zdarzyć, że różne cząsteczki (modele) będą miały taki sam współczynnik dyfuzji. Trudniej (niemożliwe) jest znaleźć dwie różne cząsteczki z dwoma takimi samymi parametrami hydrodynamicznymi (np. współczynnikiem dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej)

33. Kombinacje różnych parametrów parametry hydrodynamiczne informacje • DT - współczynnik dyfuzji • S - współczynnik sedymentacji • τ - czas relaksacji rotacyjnej • [η] - graniczna liczba lepkościowa • Mw (masa), • RH, Rg (rozmiar), • υ1, ρ(objętość właściwa, hydratacja) • a/b (kształt) • giętkość • stopień asocjacji

34. Kombinacja parametrów • DT i DR (lub τ ) • S i DT • DT i [η] • DT i Rg p=b/a lub p=L/d + informacje o objętości właściwej i hydratacji

35. Proste modele hydrodynamiczne elipsoida obrotowa wydłużona (p=a/b) BPTI elipsoida obrotowa spłaszczona (p=a/b) pałeczka (cylinder) (p=L/d) aktyna 20mer DNA

36. (F = -fv) , i = 1, 2, ..., N i vi Modele kulkowe Wymagają informacji o budowie (np. z NMR lub krystalografii) DT = kT -1 Programy obliczające parametry hydrodynamiczne na podstawie modelu kolkowego: HYDRO:http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydro/hydro.htm HYDROPRO:http://leonardo.fcu.um.es/macromol/programs/hydropro/hydropro.htm HI4 (R. Pastor - u autora)

37. a) c) b) Różne typy modeli kulkowych a) model kula-atom domeny katalitycznej CBD, b) model kulka-aminokwas inhibitora trypsyny, BPTI, c) model dużych podjednostek dla immunoglobuliny IgG3.

38. Model „powłokowy”Kulka na atom powłokowy model lizozymu (pusty w środku, shell model) pierwotny model lizozymu, model wypełniony (filling model)

39. Kulka na aminokwas

40. Kulka na nukleotyd Jedna kulka na nukleotyd Dwie kulki na nukleotyd

41. Podsumowanie • Informacje najczęściej wykorzystywane w badaniach biologicznych: • Współczynnik dyfuzji translacyjnej (DT), • Promień hydrodynamiczny (Rh), • Liczba składników w roztworze, • Masa cząsteczkowa (dla każdego składnika osobno) w połączeniu z rozpraszaniem statycznym, • Procentowy udział poszczególnych składników (w połączeniu z rozpraszaniem statycznym), • Zjawiska asocjacji i agregacji, • Kinetyka agregacji, • Oddziaływania w roztworze, • Ładunek efektywny cząsteczek, • Mody drgań wewnętrznych dla dużych obiektów (np. długie fragmenty DNA), • Kształt dużych obiektów (czynnik kształtu – pomiary kątowe).

42. Koniec  Zadania