Научный руководитель: д.х.н., проф. А.В. Пирогов

1. МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. Ломоносова Химический факультет Кафедра аналитической химии И. Д. Каргин Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с послеколоночной реакцией и флуоресцентным детектированием Научный руководитель: д.х.н., проф. А.В. Пирогов Москва, 2014

2. Тетрациклины Тетрациклин (TC) (444.43 г/моль) Окситетрациклин (OTC) (460.43 г/моль) Доксициклин (DC) (444.43г/моль) ПДК = 10 нг / г 2

3. Применение тетрациклина • Фармaкологические препараты • Ветеринария • Животноводство ПДК = 10 нг / г

4. Создание способа чувствительного определения антибиотиков тетрациклинового рядас использованием микроэмульсий методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием Изучение влияния состава микроэмульсий на флуориметрические свойства исследуемых соединений Цели работы

5. Структура микроэмульсии Вода Вода Типы микроэмульсий: А – «масло в воде» В – «вода в масле» С – биконтинуальная микроэмульсия н-октан

6. Свойства микроэмульсий

7. УФ-детектирование Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 10 мкг/мл каждого ТС). Колонка Zorbax Eclipse XDB-C18 150 × 4.6 мм (5 мкм). Градиентный режим, элюент – (А) 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH3; (В) MeCN. Градиент: (0-4 мин) 20% (В), (4-10 мин) линейное увеличение до 40% (В). F= 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

8. mAU 7 OTC + TC 5 3 DC 1 9 3 6 t , мин -1 R Режим МЭЖХ (Б) (А) Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов (с = 1 мкг/мл каждого). Элюент – (А) - МЭ (3.3% ДДСН, 0.8% н-гептана, 8% н-бутанола), (Б) - МЭ (2% ДДСН, 0.6% н-гептана, 6% н-бутанола). pH 3, F = 1 мл/мин, Т = 30°C. Спектрофотометрическое детектирование при λ = 359 нм.

9. Комплексообразование с катионами металлов Предполагаемые структуры комплексов тетрациклина с катионами магния и кальция g g У комплекса тетрациклина с катионом магния наблюдается сильное увеличение интенсивности флуоресценции ( ̴ 20 раз) 2 Спектры флуоресценции (λEx/λEm= 385 / 512 нм): 1 – 10 мкг/г ТС в МЭ 2 – 10 мкг/г ТС в МЭ + Mg2+(избыток) 1

10. Выбор pH и концентрации ионов Mg2+ с(ТС) = 10 мкг/мл, λEx/λEm= 385 / 512 нм

11. Изучение влияния природы ПАВ на флуоресценцию комплексов ТС с Mg2+ с(ТС) = 10 мкг/мл, λEx/λEm= 385 / 512 нм ДДСН ДКЗ ЦТАХ

12. Схема проведения послеколоночной реакции Ввод пробы ТС Металлический капилляр L = 2 м D = 0,25мм V = 980 мкл Т = 50°С Насос 1 Колонка Элюат Реакционная петля 20% MeCN 80% 0.01 M р-ра щавелевой к-ты рН 3 Насос 2 рН 7.8 ТС-Mg 0.06 М р-р MgCl2в МЭ состава: 4% ДДСН 1.2% н-гептана 12% н-бутанола рН 9 ФЛ детектор

13. Кинетика реакции комплексообразования • Реакция тетрациклина с ионами магния в среде микроэмульсии • Условия: МЭ (2% ДДСН, 0.6% гептана, 6% н-бутанол), содержащая 0.06 М Mg2+, pH 9, • с(ТС) = 10 мкг/мл Зависимость интенсивности флуоресценции комплекса ТС с Mg2+ от времени, λEx/ λEm= 385 / 512 нм.

14. Варьирование температуры и скорости подачи элюента Скорость подачи элюента и микроэмульсии с магнием одинакова С ростом температуры понижается вязкость МЭ

15. ОФ-ВЭЖХ с послеколоночной реакцией Хроматограмма модельной смеси тетрациклинов с концентрациями 0.05 мг/мл. Элюент: А – 0.01 M р-р щавелевой кислоты, pH = 3; В – MeCN. Градиентный режим: 0 мин – 20% А, (0 – 9) мин – 35% А, (9 – 14) мин – 35% А, (14 – 18) мин – 20% А. F = 0.4 мл/мин, Т = 50°C. Послеколоночная реакция – 60 мМ раствор MgCl2 в МЭ (4% ДДСН, 1.2% н-гептана, 12% н-бутанола). F = 0.4 мл/мин, V = 100 мкл, λEx/ λEm= 385 / 512 нм.

16. Пробоподготовка фармацевтических препаратов Навеска 0.030 г Объем МЭ – 10 мл Время экстракции – 5 минут Температура – 60 оС 2 минуты, 16 тыс. об./мин Разбавление в 100 раз смесью 80% 0.01 M р-ра щавелевой кислоты 20% MeCN

17. Анализ тетрациклиновой мази ТС Хроматограмма тетрациклиновой мази 3%.

18. Степени извлечения тетрациклина из мазей

19. Пробоподготовка молока 0.1 М р-р ЭДТА в буферном растворе МакИлвейна, рН 4 Время обработки – 5 минут 5 минут, 16 тыс. об./мин 3 мл MeCN, 3 мл H2O, 3 мл буф. р-ра 12 мл надосадочной жидкости 3 мл H2O, 3 мл буф. р-ра 1 мл MeCN 2 минут, 16 тыс. об./мин Разбавление 0,01 M р-ром щавелевой кислоты

20. Хроматограмма реального объекта (молоко) Участок хроматограммы образца молока «Лианозовское».

21. Хроматограмма реального объекта (молоко) Хроматограммы холостого образца молока (A) и молока с добавкой тетрациклинов (Б). Концентрации добавок составляли 20, 20 и 40 мкг/л для OTC, TC и DC соответственно.

22. Выводы • Впервые показано, что интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов с ионами Mg2+ в микроэмульсионной среде в 1.8 раза выше по сравнению с водно-органической средой. • Изучено влияние природы ПАВ в составе микроэмульсии на интенсивность флуоресценции комплексов тетрациклинов. Показано, что максимальная интенсивность флуоресценции наблюдается в МЭ на основе анионного ПАВ — ДДСН. • Впервые предложена схема проведения послеколоночной реакции комплексообразования тетрациклинов с ионами Mg2+ в среде микроэмульсий. • Выбраны условия чувствительного и селективного хроматографического определения тетрациклинов в виде комплексов с флуоресцентным детектированием в фармацевтических препаратах (мази и таблетки) и пищевых объектах (молоко). Пределы обнаружения составили 5, 8 и 25 нг/мл для TC, OTC и DC соответственно. • Выбраны условия извлечения тетрациклинов из молока, степени извлечения составили 87, 82 и 68% для TC, OTC и DC соответственно. Также в ходе дополнительной очистки образцов с помощью ТФЭ картриджа Strata XDB-L достигнута степень концентрирования тетрациклинов, равная 2.5. • В работе показана перспективность использования МЭ для количественного извлечения тетрациклина из лекарственных форм на основе мазей. Степени извлечения составили 99-100%. Время пробоподготовки занимает 15 минут.

23. Спасибо за внимание!