Caratterizzazione strutturale delle proteine
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Caratterizzazione strutturale delle proteine. X-ray NMR. Cristallografia a raggi X 2) NMR ( Nuclear Magnetic Resonance ). LA STORIA. Viene cristallizzata l’ emoglobina.

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Presentation Transcript

Caratterizzazione strutturale delle proteine


Caratterizzazione strutturale delle proteine

LA STORIA

  • Viene cristallizzata l’ emoglobina.

  • Röngten osserva che quando i raggi catodici (elettroni) colpiscono un bersaglio metallico si origina una nuova forma di radiazione penetrante, che egli chiamò raggi X.

  • Facendo attraversare dai raggi X un cristallo di solfuro di zinco Von Laue ottiene i primi diffrattogrammi. W.L. Bragg e W.H.Bragg propongono una correlazione semplice tra la figura di diffrazione ottenuta con i raggi X e la disposizione degli atomi nel cristallo che ha generato la figura (legge di Bragg).

  • Anni ‘30 Bernal, Crowfoot, Bragg, ottengono i primi diffrattogrammi da cristalli di proteine (insulina, emoglobina, mioglobina).

  • Atsbury ottiene il primo diffrattogramma ai raggi X del DNA.

  • Pauling e Corey propongono i concetti di struttura a-elica e foglietto b in base a considerazioni teoriche.

  • Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica del DNA sulla base delle analisi diffrattometriche ai raggi X di Franklin e Wilkins.

  • Perutz e coll. elaborano i metodi basati sull’ impiego dei metalli pesanti per risolvere il problema delle fasi nella cristallografia ai raggi X.

  • Kendrew descrive la struttura della mioglobina a una risoluzione di 2 Å. Perutz propone la struttura della emoglobina, piu’ grande, ad una risoluzione inferiore.

  • Anni ‘80 HartmutMichel risolve la struttura (3 Å) della prima proteina di membrana (centro di reazione fotosintetico).




Maurice wilkins
Maurice Wilkins

M.H.F. Wilkins, A.R. Stokes, H.R. Wilson:

Molecular Structure of Deoxypentose Nucleic

Acids. Nature 171, 738 (1953)


Rosalind franklin
Rosalind Franklin

R.E. Franklin and R.G. Gosling

Molecular Configuration in Sodium

Thymonucleate, Nature 171, 740 (1953)


Nobel laureates 1962
Nobel laureates 1962

Wilkins, Perutz, Crick, Steinbeck, Watson, Kendrew


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Cristallografia a raggi X

  • Attualmente tecnica di elezione per la determinazione di strutture 3D a risoluzione atomica

  • • Tecnica indiretta: l’immagine va ricostruita

  • • Non ci sono limitazioni nelle dimensioni delle macromolecole

  • • Svantaggi:

  • – cristalli singoli

  • – altamente ordinati

  • – ragionevolmente grandi (80-100 μM)


Cristallografia a raggi x
Cristallografia a raggi X

Precisa determinazione della posizione atomica

Cristallidellaproteina

  • 0.3-1.0 mm

  • Le singolemolecolesono ordinate in modoperiodico, ripetitivo

    Salting out non è sufficiente


Caratterizzazione strutturale delle proteine

La solubilità della proteina è determinata dalle interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina

Lys, Arg, Asp, Glu

Un eccesso di forza ionica della soluzione favorisce le solvatazione degli ioni stessi a scapito della solvatazione della proteina. Il sale compete con la proteina e la solvatazione diminuisce all’aumentare della forza ionica

L’aumento della forza ionica della soluzione favorisce la interazione tra le cariche superficiali della proteina ed il solvente polare


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Polietilenglicole: interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteinaproteina precipita, ma rimane in contatto con l’acqua.

Struttura ordinata con indice di rifrazione diverso

rispetto a quello del mezzo in cui si trova


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Perchè i raggi X? interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina

Per poter visualizzare due oggetti come entità separate, la lunghezza d’onda della radiazione elettromagnetica deve essere dello stesso ordine di grandezza della distanza tra gli oggetti:

distanza interatomica ≈1Å (10 nm)

λraggiX= 0.1 ÷ 2 Å

con i raggi X “vedo” gli atomi


Visione d insieme del processo
Visione d’insieme del processo interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina

RX

FFT

Cristallizzazione Diffrazione

Risoluzione della struttura

e affinamento


Perch un cristallo
…perché un cristallo? interazioni soluto solvente dovute alle cariche superficiali della proteina

L’immagine di diffrazione da una singola molecola si forma per interazione dei raggi X con gli elettroni degli atomi della molecola

MA: - è troppo debole

- impossibile separarla dalla radiazione di fondo (soluzione)

Impossibile ricostruire la molecola


Caratterizzazione strutturale delle proteine

In un cristallo, miliardi di molecole sono disposte in modo ripetuto e ordinato

nelle tre dimensioni

Cristallo è amplificatore del segnale

buone immagini di diffrazione

si può ricostruire la molecola

100 mg!!


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Schmid, M. Trends in Microbiology, ripetuto e ordinato10:s27-s31.


Instrumentation
Instrumentation ripetuto e ordinato

or synchrotron X-rays


Instrumentation1

Instrumentation ripetuto e ordinato

ESRF - Grenoble


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Instrumentation ripetuto e ordinato

Elettra - Trieste


Caratterizzazione strutturale delle proteine

The Bragg law ripetuto e ordinato

Facendo incidere un'opportuna onda elettromagnetica su di un cristallo si osservano

fenomeni di interferenza, causate dalla riflessione di onde riflesse da piani cristallini

diversi, ma paralleli.

l = 2 d sinq

Dove:

- θ è l'angolo che il fascio incidente forma

con il piano cristallino

- λ è la lunghezza d’onda della radiazione- d è la distanza tra due piani adiacenti.

sinq/l = 1/(2 d)

d = l / (2 sinq)


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Acqua ripetuto e ordinato

Agente precipitante

Soluzione cristallizzante

acqua/acetone cloroformio o cloruro di metilene/etere di petrolio o esano


Crystal growth
Crystal growth ripetuto e ordinato


Crystal growth1
Crystal growth ripetuto e ordinato


Abbiamo ottenuto le mappe e poi
Abbiamo ottenuto le MAPPE … e poi? ripetuto e ordinato

+ =

Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D

  • La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione.

  • • La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.


Risoluzione
Risoluzione ripetuto e ordinato


Esempio la proteasi del virus hiv
Esempio: la proteasi del virus HIV ripetuto e ordinato

La cavità centrale è ampia e

può legare un polipeptide in conformazione estesa


Caratterizzazione strutturale delle proteine

KNI577 ripetuto e ordinato

  • La tasca è stata “riempita” con analoghi non idrolizzabili del substrato: inibitori competitivi altamente specifici e selettivi

  • Nuova generazione di farmaci “intelligenti” con pochi effetti

  • collaterali inibitori non competitivi altamente specifici e selettivi


Caratterizzazione strutturale delle proteine

MODULATION OF HEME AND MYRISTATE BINDING TO HUMAN ripetuto e ordinato

SERUM ALBUMIN BY ANTI-HIV DRUGS. AN OPTICAL AND NMR

SPECTROSCOPIC STUDY(FEBS J. 274 (2007) 4491-4502)

Superimposition of myristate and abacavir (panel A), nevirapine (panel B),

and atazanavir (panel C) in binding site FA6. Ligands are colored as follows:

myristate: green; abacavir: blue; nevirapine: orange; atazanavir: cyan.

Atomic coordinates were taken from the PDB entry 1O9X (Zunszain et al., 2003).


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Heme Binding to Albuminoid ripetuto e ordinato

Proteins is the Result of Recent Evolution,

IUBMB Life 59, 436-440 (2007).


2 nmr
2) NMR ripetuto e ordinato

  • Tecnica spettroscopica per lo studio della struttura di macromolecole a risoluzione atomica

  • • È basata sull’interazione dei singoli nuclei atomici magneticamente attivi - 1H, 15N, 13C e 31P - con il campo magnetico esterno e con i campi magnetici dei nuclei adiacenti

Informazioni di:

– dinamica

– conformazione

– folding

– interazioni intermolecolari


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Campo magnetico ripetuto e ordinato

NOE (Nuclear Overhauser Effect)


Il campo magnetico
Il campo magnetico ripetuto e ordinato

Magnete a 400 MHz

Magnete a 900 MHz

Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M €

n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10



The magnet
The Magnet ripetuto e ordinato

History

First magnets were built using

ferromagnetic material=

permanent magnet

Then Electromagnets:

i.e. field was generated by wiring of conducting material

Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

A “cutted” magnet


Caratterizzazione strutturale delle proteine

Orbita di precessione ripetuto e ordinato

B0

Dipolo magnetico

μN

Nucleo

La rotazione dei nuclei atomici su sé stessi è capace di procurare un momento magnetico μ se i nuclei sono carichi.

Solo nuclei con numero atomico dispari mostrano proprietà magnetiche: si dice che il loro numero quantico di spin è ±1/2.

Solo particelle dotate di spin sono in grado di disporsi in diversi livelli energetici se immerse in un campo magnetico.

Momento magnetico

Frequenza di Larmor


L energia della transizione nmr
L’energia della transizione NMR ripetuto e ordinato

Si applica un campo magnetico B0:

il momento magnetico del protone tenderà ad allinearsi con il campo esterno.

Si creano due livelli energetici: uno, ad energia più alta, in cui il suo momento

magnetico si oppone al campo esterno; uno, ad energia più bassa,

in cui è allineato.

m=-1/2

E= -m•B0

DE=h0

DE=g(h/2p)B0

E

m=+1/2

B0

Larmor Frequency

Il campo magnetico B0 serve per creare

la separazione di energia tra i 2 livelli


L energia della transizione nmr1
L’energia della transizione NMR ripetuto e ordinato

E= -m•B0

DE=g(h/2p)B0

Devo applicare una radiofrequenza = alla frequenza DE=h0

Per stimolare la transizione!

E

m=-1/2

DE=h0

Il campo di radiofrequenza utilizzato per eccitare la transizione

si chiama anche B1

m=+1/2

B0

Larmor Frequency

B1 deve emettere una radiofrequenza in corrispondenza della frequenza di Larmor


Some paradigmatic examples
Some paradigmatic examples ripetuto e ordinato


Caratterizzazione strutturale delle proteine
Why? ripetuto e ordinato

NMR is a unique method to obtain information in solution

AT THE ATOMIC LEVEL.

Each individual atom has a peculiar resonance frequency.

Because the resonance frequency depends on the environment of the atom, EACH atom has a different resonance frequency and can, therefore be identified

CH3-CH2-OH

equivalent


Nmr spectrum to 3d structure

H ripetuto e ordinato

H

H

H

H

H

H

Structure

H

Interactions

H

H

H

Spectrum

NMR Spectrum to 3D Structure


Challenges for determining protein structures using nmr
Challenges For Determining Protein Structures Using NMR ripetuto e ordinato

  • Proteins have thousands of signals

  • Assign the specific signal for each atom

  • Thousands of interactions between atoms- also need to be assigned

  • Need to transform from NMR spectrum through interpretation of scalar and dipolar interactions to generate 3D coordinates


Resonance assignment

OH ripetuto e ordinato

CH2

CH3

The key attribute: use the scalar and dipolar couplings to match the set of signals with the molecular structure

Resonance Assignment

CH3-CH2-OH

Which signal from which H atoms?


Proteins have many signals
Proteins Have Many Signals ripetuto e ordinato

1H NMR Spectrum of Ubiquitin

~500 resonances

  • A large number of signals are overlapped


A critical feature of protein nmr spectra
A Critical Feature of ripetuto e ordinatoProtein NMR Spectra

  • Only some nuclei are coupled

  • Each amino acid gives rise to an independent NMR sub-spectrum, which is much simpler than the complete protein spectrum

Methods have been developed to extract each sub-spectrum from the whole


Critical features of protein nmr spectra
Critical Features of ripetuto e ordinatoProtein NMR Spectra

  • The nuclei are not all mutually coupled

  • Regions of the spectrum correspond to different parts of the amino acid

  • Tertiary structure leads to increased dispersion of resonances


Regions of the 1 h nmr spectrum are further dispersed by the 3d fold
Regions of the ripetuto e ordinato1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold

What would the unfolded protein look like?


Proteins have overlapped signals
Proteins Have Overlapped Signals ripetuto e ordinato

1H NMR Spectrum of Ubiquitin

Spettri monodimensionali presentano differenze di c.s. < potere risolutore

  • Resolve resonances by multi-dimensional experiments


Resolve peaks by multi d nmr
Resolve Peaks By Multi-D NMR ripetuto e ordinato

A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints

If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..


Solution to the protein challenge

t ripetuto e ordinato2

t1

t3

Solution to the Protein Challenge

  • Increase dimensionality of spectra to better resolve signals: 1234

  • Detect signals from heteronuclei (13C,15N)


Nmr structure calculations
NMR Structure Calculations ripetuto e ordinato

  • Objective is to determine all conformations consistent with the experimental observables

  • NMR data is not perfect: noise, incomplete

    Multiple solutions: caused by uncertainties

    in the experimental constraints


Conformational ensemble representing an nmr structure

C ripetuto e ordinato

N

Conformational Ensemble Representing an NMR Structure


Risonanza magnetica nucleare nmr
Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) ripetuto e ordinato

  • Proteine in soluzione

  • Limite di dimensione ~ 40 kDa

  • Proteine stabili a lungo

  • Marcatura con 15N, 13C, 2H.

  • Strumentazione molto costosa

  • Tempo per assegnare le risonanze


Pro e contro

X-ray ripetuto e ordinato

Richiede cristalli, problematico

Non ha limiti (teorici) di grandezza

Piú preciso

Risoluzione

Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida

Una “soluzione“

NMR

Possibile in soluzione, più semplice

Limitato a proteine fino a circa 300 residui

Meno preciso

Numero di vincoli

Struttura nativa in soluzione, flessibile

Molti modelli

Pro e contro


Caratterizzazione strutturale delle proteine

X-ray ripetuto e ordinato

NMR