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实验十八 （ 1 ）农杆菌感染烟草叶片与共培养

实验十八 （ 1 ）农杆菌感染烟草叶片与共培养. 一、原理 根癌土壤农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens ）是天然的植物基因工程载体之一，能感染 93 科 331 个属 643 个种的双子叶植物，将 Ti 质粒上的 T-DNA 转移并整合到植物基因组，其基因表达引发冠瘿瘤病。 经过改造的 Ti 质粒，删除了致瘤基因，能将目的基因重组到具有 T-DNA 两端序列的质粒载体上，实现通过外源基因转移改良植物品种的目的。常用的载体系统是双元载体系统。. 胭脂碱型.

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实验十八 （ 1 ）农杆菌感染烟草叶片与共培养

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  1. 实验十八 （1）农杆菌感染烟草叶片与共培养 一、原理 根癌土壤农杆菌（ Agrobacterium tumefaciens）是天然的植物基因工程载体之一，能感染93科331个属643个种的双子叶植物，将Ti质粒上的T-DNA转移并整合到植物基因组，其基因表达引发冠瘿瘤病。 经过改造的Ti质粒，删除了致瘤基因，能将目的基因重组到具有T-DNA两端序列的质粒载体上，实现通过外源基因转移改良植物品种的目的。常用的载体系统是双元载体系统。

  2. 胭脂碱型 acs：农杆菌素碱基因；agc：农杆菌素碱分解代谢基因；arc：精氨酸分解代谢基因；noc：胭脂碱分解代谢基因；nos：胭脂碱合成基因；tra：质粒转移基因；ori：复制起点；vir：毒性区，包含多个致病基因

  3. T-DNA结构示意

  4. 双元载体系统

  5. nptII gus

  6. 二、材料 烟草，农杆菌LBA4404，质粒pBI121 三、方法 共培养方法

  7. 四、步骤 1、农杆菌培养 （1）取新鲜菌落（液）于2ml YEB培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str和50mg/L Kan）中，28 ℃下，180rpm震荡培养过夜。 （2）将2ml菌液转入20ml培养基（含50mg/L Rif、30mg/L Str和50mg/L Kan）中，培养5~6小时左右。 （3）菌液达到OD600＝0.2～0.5时用于转化。

  8. 2、感染 （1）取烟草幼叶，表面消毒（方法同上次实验），剪切成0.5~1.0cm-2大小。 （2）将叶片放入菌液中，在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。 3、共培养 （1）将叶片置于无菌滤纸上吸去多余的菌液。 （2）接种在MS培养基上（0.02mg／L NAA＋0.2mg／L BA），在25~28℃黑暗条件下共培养2~3天。每组接种20瓶。

  9. 4、筛选转化细胞和诱导器官发生 （1）将共培养后的叶片转移到MS筛选培养基上： MS+0.2mg/L BA+0.02mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%琼脂，高压灭菌，用前融化后冷却到60 ℃时加入100mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素（抗生素贮存液1000×，过滤灭菌，在-20 ℃下保存 ）。各组每次200ml。 （2）每3天更换一次培养基。培养条件同前。

  10. 下次实验准备（均高压灭菌） 1、CPW培养基+0.4mol/L甘露醇，pH 5.4，各组（4人）60ml，分装成10ml、10ml和20ml、20ml。 2、20％PEG600，0.06mol/L CaCl2，0.3mol/L甘露醇。各组（4人）20ml 3、1mol/L 甘氨酸-NaOH，pH10.0 。各组（4人）10ml。 4、W5稀释液：125mmol/L CaCl2，155mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，5mmol/L葡萄糖，pH5.6。各组（4人）50ml 5、其他需要高压灭菌的用具同本实验。

  11. 其他需要高压灭菌的用具： 过滤器（2），注射筒（1），不锈钢网筛（=54m）（1），漏斗（1），三角瓶（5），滴管（10支），10ml刻度离心管（2支）。 国庆节期间进入实验室安排： 10月1日，10月3日，10月5日上午9：00~11：00李老师在实验室，其他时间来实验室找同学开门。

  12. 祝同学们： 节日快乐！

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