Download
1 / 20
230 likes | 626 Views
ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОоорганизмов. Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ». Проблема: Устойчивость
E N D
ДНК-МИКРОЧИПЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОоорганизмов Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»
Проблема: • Устойчивость • микроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков • Причина : • Продукция бактериальных ферментов – • бета-лактамаз
Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики 1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli 1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1 Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз S S H2O HN N O OH COOH COOH
Классификация семейства бета-лактамаз VIM SPM IMP GIMSIM OXA KPC TEM SHV CTX-M • Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) • Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы • Карбапенемазы
Задача: одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них Возможное решение: • использование молекулярно-генетических методов • использование мультипараметрических методов исследований
Биологические микрочипы Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекул в виде миниатюризированных матриц на специальном носителе Микрочип Метод ДНК-зондов
Особенности технологии микрочипов • Одновременное определение множества параметров • Миниатюризация • Автоматизация • Высокая производительность
Метод гибридизационного анализана ДНК-микрочипах Детекция результатов гибридизации по активности метки • Амплификация • гена (ПЦР) • Введение метки Гибридизация Выделение ДНК
Детекция результатов гибридизационного анализа Микрочипы с флуоресцентной детекцией Микрочипы с колориметрической детекцией Фермент Cy3 Бт Окрашенный продукт Субстрат 9
Идентификация типа гена C U C G A A G A G T T G U G C U A A G A T C C C Прямая цепь Обратная цепь
Выявление точечных мутаций в генах 151 ...GSGHYGT... ...GSGRYGT... TEM-1 TEM-21 A G C T TEM-1 TEM-21 Анализ нуклеотидных последовательностей генов
ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивыхбета-лактамаз Носитель:найлон Размер чипа:8 мм х 14 мм Диаметр точки:~ 350 µm Количество точек:246 Количество зондов: 78 • Идентификация: • 3 типа генов β-лактамаз: TEM, SHV и СТХ-М • 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ Контроль иммобилизации Отр. контроль гибр. Полож. контроль гибр. Идентификация типа гена Мутации в blaTEM Мутации в blaSHV Мутации в blaСТХ-М
TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринамI поколения) Интенсивность, отн. ед. TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15(устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринамI-IV пок-ний) Интенсивность, отн. ед. 13
Результаты тестирования штамма K. pneumonia, продуцирующего три β-лактамазы:TEM-1, SHV-1 и СTX-M-9 SHV-1 CTX-M-9 TEM-1 Интенсивность, отн. ед.
Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100) БЛРC – (n = 10): БЛРС+ (n = 90): SHV-5-like CTX-M-1-like CTX-M-2-like CTX-M-9-like TEM-1-like +SHV-2-like TEM-1-like + SHV-5-like TEM-1-like +CTX-M-1-like TEM-1-like +CTX-M-9-like SHV-1-like +SHV-5-like SHV-1-like +CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-2-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-5-like TEM-1-like + SHV-1-like +CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like +CTX-M-9-like SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like +SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like +SHV-2-like + CTX-M-2-like TEM-1-like +SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like +SHV-5-like + CTX-M-9-like SHV-1-like +SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-1-like +SHV-5-like + CTX-M-1-like SHV-1-like +SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-2-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like +SHV-5-like + CTX-M-2-like Не обн. ТЕМ-1 SHV-1 (TEM-1+ SHV-1) 20% 20% 10% 50% 24,6%штаммов продуцировали 2 БЛРС
ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Id_IMP Id_VIM Id_OXA IMP-1 VIM-1 OXA-23 IMP-2 VIM-2 OXA-40 IMP-5 VIM-7 OXA-51 IMP-11 Id_SPM OXA-58 Носитель: найлон Размер микрочипа: 11мм×15мм Диаметр одной точки: 350 мкм Количество точек: 132 IMP-14 Id_SIM Id_KPC Id_GIM Идентификация карбапенемаз: VIM, IMP, SPM, GIM, SIM(класс B) OXA( класс D) KPC(класс A) Контроль иммобилизации Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации Идентификация для металло-β-лактамаз Идентификация OXA-β-лактамаз Идентификация KPC-β-лактамаз
Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах
Интегрированный ДНК-микрочип для идентификации β-лактамаз Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамазкласса А и карбапенемаз классов A, B, D
Благодарности: Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В. НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В. Институт нейрохирургииим. Н.Н. Бурденко Александрова И.А. Финансовая поддержка: ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К)
