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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire

Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire. Laurence Martel 19 décembre 2002. UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires. Plan de l’exposé. Contexte : relations structure/fonction des protéines

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Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire

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  1. Méthodes d’analyse de surface appliquées à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire Laurence Martel 19 décembre 2002 UMR 5819 CNRS-CEA-UJF Structures et Propriétés d’Architectures Moléculaires

  2. Plan de l’exposé • Contexte : relations structure/fonction des protéines • Méthodes d’analyse de surface • Élaboration de monocouches de protéines • Techniques d’étude expérimentale • Réflectivité X • Ellipsométrie • Modélisation des courbes expérimentales • Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire • Présentation des cadhérines • Rôle du calcium • Interaction entre fragments • Conclusions et perspectives

  3. Relations structure/fonction des protéines Sticholysine II : résolution 1,5 nm (Martin-Benito et al. 2000) C-Cadhérine : résolution 0,308 nm (T. Boggon et al. 2002) • Cristaux 2D par microscopie électronique à transmission ou AFM résolution ~ 1 nm Hypothèses sur la fonction de la protéine 1,2nm Positions des atomes Reconstruction 3D de la structure Enveloppe de la protéine • Formation de complexes de protéines • Immobilisation des protéines sur une surface Informations sur les interactions entre protéines • Structure cristallographique de protéines obtenues à partir de • Cristaux 3D par Rayons X résolution atomique (jusqu’à 0,1 nm) Objectifs de cette étude Développer une méthodologie pour étudier les interactions entre protéines immobilisées et protéines en solution

  4. Plan de l’exposé • Contexte : relations structure/fonction des protéines • Méthodes d’analyse de surface • Élaboration de monocouches de protéines • Techniques d’étude expérimentale • Réflectivité X • Ellipsométrie • Modélisation des courbes expérimentales • Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire • Présentation des cadhérines • Rôle du calcium • Interaction entre fragments • Conclusions et perspectives

  5. Élaboration de couches de protéines • 1ère Étape : Formation d’une monocouche de lipides à la surface de l’eau • Dépôt de lipides ligands chélatant un ion Ni2+ : Ni-NTA-DLGE • + Lipides diluants pour la fluidité de la monocouche lipides diluants lipides ligands

  6. Élaboration de couches de protéines • 2ème Étape : Injection de protéines • Ancrage par liaison de coordination • histidine-nickel Exemple: Injection de cadhérines-His6

  7. Élaboration de couches de protéines • 3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase Étude des interactions entre protéines Exemple: Injection de fragments

  8. Élaboration de couches de protéines • 3ème Étape : Injection d’autres protéines ou molécules d’intérêt dans la sous-phase Étude des interactions entre protéines

  9. Techniques d’étude expérimentale Informations recherchées Mesurer la quantité de protéines ancrées aux lipides Sans marqueur Sans transfert de la couche de protéines Suivi de l’évolution en temps réel et in situ Ellipsométrie à la surface de l’eau Résolution 0,5 mg/m2 = 0,5 ng/mm2 Résonance des plasmons de surface sur surface solide Déterminer la structure verticale de la couche Réflectivité des rayons X Résolution verticale 1 nm

  10. 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante • Ligne de lumière Troïka II, ESRF (Responsable O. Konovalov) • Goniomètre Cellule échantillon Faisceau synchrotron monochromatique

  11. 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Réflectivité I/I0 • Mesure de l’intensité réfléchie spéculaire Cas d’une interface simple : Air-Eau  qz-4

  12. 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Réflectivité I/I0 Cas d’une couche sur un substrat : Lipides sur eau

  13. 1. Réflectivité des rayons X en incidence rasante • Courbe de réflectivité complexe • Avantage de l’ESRF : la brillance du faisceau synchrotron permet de mesurer jusqu ’à des vecteurs de diffusion q~0,5 Å-1 soit une résolution de ~6,5 Å • Nécessité d’une méthode d’analyse des données avec un modèle du système étudié • Monocouche de fragments de C-cadhérine • Lipides ligands Ni-NTA-DLGE Cas d’une couche complexe sur un substrat : Protéines ancrées aux lipides sur eau

  14. 2. Ellipsométrie Cas des lipides sur l'eau Relation entre la mesure et l’indice de réfraction Suivi des variations des angles ellipsométriques  et  en fonction du temps, de , de  Indice eau n=1.333 Paramètres des lipides : n=1.448 d=2,5 nm • Mesure du rapport des coefficients de réflexion des polarisations p et s de la lumière autour de l’angle de Brewster

  15. 2. Ellipsométrie Suivi de l’adsorption de C-cadhérine à une monocouche de lipides ligands Ni-NTA-DLGE [Ca2+] = 0,5 mM Mesures angulaires après 2h, puis après 17h30 Conséquences Non-linéarité de la variation de  et de  avec l’adsorption à angle fixe Interprétation des mesures cinétiques ? 17h30 2h 17h30 2h • Problème soulevé pour une couche épaisse (>10nm) • Déplacement de la courbe ellipsométrique angulaire vers les grands angles

  16. Modélisation du système lipides+protéines • Système à N couches (, d)N • Équations de Fresnel • Simulation des courbes par un calcul matriciel d’Abélès • Objectif : Comparer les données expérimentales avec une courbe théorique pour déduire les paramètres (, d) caractérisant le système • Programmes de calcul : • Réflectivité X : Parratt32 (HMI Berlin), R. Ober • Paramètres ajustables : densité électronique , épaisseur d, rugosité  • Ellipsométrie (et Résonance de Plasmon de Surface) : ce travail • Paramètres ajustables : indice de réfraction n, épaisseur d

  17. Réflectivité des rayons X en incidence rasante Réflectivité I/I0 • Modèle de profil de densité électronique des lipides • 2 couches : 7 paramètres d'ajustement (,d,) Air Eau Tête polaire et groupement Ni-NTA Chaîne carbonée

  18. Réflectivité des rayons X en incidence rasante • 30 couches : d=0,7 nm, =0 nm •  30 paramètres d'ajustement ()N • Modèle de profil de densité électronique d’une monocouche de fragments de C-cadhérine

  19. Comparaison ellipsomètrie et réflectivité X :masse adsorbée par unité de surface • Ellipsométrie : Approximation de De Feijteret al. (1978) dn/dc ~ 0,19 cm3/g : incrément d’indice de la solution de protéine • Masse de C-cadhérine adsorbée aux lipides Ellipsométrie [Ca2+] = 0,5 mM Réflectivité X [Ca2+] = 5 mM Après 2h : 6,0 ± 0,5 mg/m2 Après 4h : 8,1mg/m2 Après 17h30 : 8,7 ± 0,5 mg/m2 • Réflectivité X : Aire sous le profil de densité électronique, lipides soustraits <P> ~ 0,417 e.Å-3 :densité électronique moyenne de la protéine Rem rapport masse / électron dans la protéine sèche

  20. Résultats • Application à l’étude des interactions entre protéines d’adhérence cellulaire • Mises au point • Technique d’élaboration de monocouches de protéines • Techniques expérimentales d’analyse de surface complémentaires • Modélisation du système en multicouches • Ellipsométrie • Mesure des angles ellipsométriques  et  • Ajustement pour obtenir <n> et <h> • Estimation de la masse adsorbée apparente de protéines ancrées aux lipides • Mesures cinétiques : 1 point / 3 secondes • Réflectivité des rayons X • Mesure de l’intensité réfléchie • Ajustement pour obtenir le profil de densité électronique perpendiculaire à la surface • Calcul de la masse de protéines adsorbée aux lipides

  21. Plan de l’exposé • Contexte : relations structure/fonction des protéines • Méthodes d’analyse de surface • Élaboration de monocouches de protéines • Techniques d’étude expérimentale • Réflectivité X • Ellipsométrie • Modélisation des courbes expérimentales • Applications à l’étude de protéines d’adhérence cellulaire • Présentation des cadhérines • Rôle du calcium • Interaction entre fragments • Conclusions et perspectives

  22. Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérence • Exemple des cellules de l’endothélium vasculaire Plusieurs familles de Protéines d’Adhérence Cellulaire

  23. Adhérence cellulaire et molécules d ’adhérence ~23nm • Famille des cadhérines • Glycoprotéines transmembranaires • Sur tous types de cellules • Différentes cadhérines selon les cellules : • VE-cadhérine humaine (Vascular Endothelium) • C-cadhérine de Xenopus • 5 domaines extracellulaires homologues (EC) • 12 ions Ca2+/cadhérine pour un bon repliement

  24. Interaction entre molécules d ’adhérence • Concentrations critiques en calcium • Perz et al. 1999 mM [Ca2+] trans 1 cis 0,5 pas d’interaction 0,05 dénaturation 0 • Interactions entre domaines extracellulaires de cadhérine • parallèles et anti-parallèles

  25. Problématique : interaction entre cadhérines? C-cadhérine : Interactions trans selon 3 alignements E- et N-cadhérine : Interaction trans par domaines N-terminaux (mesures de force de surface) • Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? • Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? • Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution

  26. Problématique : interaction entre cadhérines? • Quelle loi d’assemblage entre les fragments extracellulaires de cadhérine ? • Quels domaines impliqués dans les interactions cis et trans ? • Modèles actuels d’après résolutions de structure 3D et études en solution VE-cadhérine : Formation d’hexamères du fragment VE-EC1-4 modèle d’interaction trans

  27. Les protéines recombinantes étudiées C-cadhérine Collaboration Deborah Leckband - UIUC, Urbana Fragment principal : C-EC1-5 His • VE-cadhérine • Collaboration Danielle Gulino - IBS, Grenoble • Fragment principal : VE-EC1-4 His ~19 nm ~23 nm Parties extracellulaires seulement

  28. Objectif de l’étude des cadhérines Approche expérimentale Caractérisation de couches de cadhérines par ellipsométrie : masse adsorbée par réflectivité X : structure verticale 1) Variation de la concentration en calcium Suivi de la masse adsorbée Évolution de la structure des couches 2) Interactions entre fragmentsde différentes longueurs Questions posées Structure et alignement cis ou trans le long des complexes de C-cadhérine? le long des hexamères de VE-cadhérine?

  29. Monocouche de C-cadhérine en présence de calcium Épaisseur totale ~16 nm Modèle d’interactions des cadhérines dans la couche • D’après la structure de T. Boggon et al. (2002) • Inclinaison moyenne de 50° / surface Complexes cis ou trans? • Monocouche de fragments C-EC1-5His avec [Ca2+] = 5 mM • Lipides ligands Ni-NTA-DLGE • Après 4 heures d’incubation

  30. Influence de la concentration en calcium sur une couche de cadhérines [Ca2+] < 0,5 mM Pas de variation attendue - calcium Perte de masse due à Décrochement de cadhérines Dissociation des complexes • Cadhérine sensible aux variations de la concentration calcium ? [Ca2+] > 1 mM Monomères ou complexes cis Complexes trans

  31. Dissociation de complexes de C-cadhérine Masse apparente de protéine adsorbée • A • B • C • [Ca2+] =5mM • [EGTA]=10mM • [Ca2+] =10mM • 7,0 mg/m2 • 5,8 mg/m2 • 6,7 mg/m2 • -17% • -5% • Perte de masse après l’ajout d’EGTA • La masse initiale de C-cadhérine est retrouvée à 95% par simple ajout de calcium • 34% des fragments en complexes trans A B C • Influence de l’agent chélatant d’ions divalents EGTA sur une monocouche de C-cadhérine Ellipsométrie : Suivi cinétique de  et 

  32. Dissociation de complexes de C-cadhérine Dilution de la sous-phase Profils de densité électronique • 7,5 mg/m2 • 6,4 mg/m2 Perte de masse après dilution 30% de fragments en complexes trans • -15% Conclusion Pertes de masse et déstructuration des couches de C-cadhérines • À partir d’une couche élaborée sur forteconcentration en calcium Réflectivité X

  33. Conclusion sur la C-cadhérine • Cadhérines immobilisées sensibles au calcium • Cadhérines inter-digitées dans la monocouche • Dissociation de complexes trans de C-cadhérines [Ca2+] = 1 mM [Ca2+] = 0,1 mM • Mais … • Les fragments possèdent tous une étiquette histidine

  34. Interactions entre fragments de VE-cadhérine Trois mélanges de fragments VE-EC1-4 et de fragments courts Rapport 1:100 (EC1-4:court) pour favoriser la formation de complexes mixtes en solution • Localisation des interactions entre cadhérine le long de la protéine ? Interactions établies en solution entre fragments identiques de VE-cadhérine (S. Bibert et al. 2002)

  35. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Fragment 1-4 seul

  36. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 ~19 nm ~23,3 nm Épaisseur totale ~ 21 nm Hexamères en surface ? • Fragment 1-4 seul

  37. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Fragment 1-4 + fragment 1-3

  38. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 Profil de densité électronique similaire au cas du fragment 1-4 seul • Fragment 1-4 + fragment 1-3

  39. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Fragment 1-4 + fragment 2- 4

  40. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Profil similaire à celui des lipides • Pas d'interaction lipide-cadhérine • Fragment 1-4 +fragment 1-3 • Fragment 1-4 + fragment 2- 4

  41. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Fragment 1-4 + fragment 3-4

  42. Interactions entre fragments de VE-cadhérine His6 • Profil similaire à celui des lipides • Pas d'interaction lipide-cadhérine • Fragment 1-4 +fragment 1-3 • Fragment 1-4 +fragment 2-4 • Fragment 1-4 + fragment 3-4

  43. Conclusion sur la VE-cadhérine Dans l’hexamère ? La formation de complexes bloque l’étiquette histidine Importance du domaine EC4 • Modèles d’interaction entre cadhérines • Ancrage de protéines aux lipides dans le cas du mélange EC1-4/EC1-3 • Pas d’ancrage de protéines aux lipides dans le cas des mélanges EC1-4/EC2-4 et EC1-4/EC3-4 Entre fragments de longueurs différentes

  44. Conclusion sur la VE-cadhérine • Modèles d’interaction entre cadhérines • En plusieurs étapes ? • Formation de complexescis puis de complexestrans • Mélange de complexes en surface ?

  45. Conclusions • Sur l’étude des cadhérines • Dissociation de complexes et déstructuration de la monocouche de C-cadhérine par appauvrissement de la sous-phase en calcium • Il existe des complexes anti-parallèles totalement enchevêtrés en surface • Importance du domaine EC4 dans les interactions entre fragments de VE-cadhérine • Hexamères en surface ? • Sur la méthodologie développée • Ellipsométrie • Nécessaire prise en compte de la non-linéarité de  et de  avec l’adsorption (mesures à angle fixe) • Estimation quantité de matière adsorbée en surface, Résolution 0,5 mg/m2 • Suivi de la quantité de matière adsorbée en temps réel • Réflectivité des rayons X • Des profils de densité électronique complexes rendent compte de changements fins dans la couche de protéines • Résolution ~ 1 nm (suivant lanormale à la couche)

  46. Perspectives • Étude des Cadhérines • Étude des interactions entre cadhérines immobilisées avec • Un plus grand nombre de fragments courts différents • Fragments sans étiquette histidine • Structure de complexes cristallisés à 2 dimensions (VE-cadhérine : thèse R. Al-Kurdi) • Questions ouvertes • Observations de différences d’affinités en surface et en volume • Faible action de l’agent chélatant EGTA sur le nickel des lipides ligands ? • Modélisation de la Réflectivité X • Améliorer la modélisation en tenant compte de • Couches d’épaisseursvariables • Conservation du nombre d’électrons dans une couche • Monocouche de protéines sur Surfaces Solides • Manipulation des échantillons facilitée • Étude par Résonance de Plasmons de Surface et Réflectivité de rayons X durs

  47. Perspectives • Appareil de mesure de la Résonance de Plasmons de Surface

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