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Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere

Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere. B asi biologiche dell’uso delle MSCs Dr Eugenio Boux Dr Alberto Siclari P.O. Di Biella ASLBI. Mesenchymal stem cell MSC. CELLULE STAMINALI. Indifferenziate

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Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere

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Presentation Transcript

  1. Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere Basi biologiche dell’uso delle MSCs Dr Eugenio Boux Dr Alberto Siclari P.O. Di Biella ASLBI

  2. Mesenchymal stem cell MSC

  3. CELLULE STAMINALI • Indifferenziate • Capaci di autorigenerarsi ( self-renewal) • Capaci di differenziarsi in tipi cellulari specifici • Capaci di ripopolare un dato tessuto in vivo

  4. TOTIPOTENTI: capaci di dar luogo a tipi cellulari embrionali e non. • PLURIPOTENTI: capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un embrione a sei settimane, cellule isolate da feto a termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti adulti). • MULTIPOTENTI: capaci di dar luogo a cellule appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells). • OLIGOPOTENTI: capaci di dar luogo a un ristretto subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge stem cells). • UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).

  5. CELLULE STAMINALI ADULTE Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o tessuti adulti, capaci di AUTORIGENERARSI e di DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari del tessuto o organo preso in considerazione

  6. Le cellule mesenchimali staminali • Sonoconosciuteanche come: • colony forming fibroblastic cells • stromal fibroblasts • marrow stromal stem cells • mesenchymal progenitor cells

  7. Le cellule mesenchimali sono cellule non-emopoietiche stromali che hanno la capacità di differenziarsi in diverse linee . • Condroblasti • Osteoblasti • Adipociti • Cellule neurali • Miociti

  8. E’ possibile guidare le MSCs in uno specifico tipo anche in laboratorio usando adatti fattori di crescita o specifiche sostanze • ( ad esempio il blu di toluidina le differenzia in condroblasti ) MF Pittinger et al.Multilineage potential of adult human MSCs Science 1999; 284 :143-7

  9. Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214

  10. CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC

  11. Sono cellule mobili? Le MSCs hanno la capacità di muoversi e rispondono alla chemiotassi . WR Otto Tomorrow’s skeleton staff MSC and the repair of bone and cartilage Cell Prolif 2004 ; 37: 97-110 Dopo le microfratture si ritrovano nell’articolazione J. Kramer et al. “In vivo matrix-guided human mesenchymal stem cells” Cellular and molecular life sciences 2006,vol 63 n°5 pp. 616-626

  12. Le funzioni delle MSCs • Supportare l’ematopoiesi • Attrarre le HSC (hematopoietic stem cells) circolanti nel midollo (homing) • Immunosoppressione • Riserva di cellule • Produzione di sostanze bioattive ( magazzino!)

  13. supportare l’ematopoiesi Le MSC supportano l’ematopoiesi attraverso interazioni cellula- cellula.

  14. attrarre le HSC nel midollo (homing)

  15. effetto immunosoppressivo Le MSC hanno un ruolo importante nella maturazione dei linfociti T, B e NK e delle cellule dendritiche.

  16. Riserva di cellule • Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo, del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello stroma che supporta l’ematopoiesi.

  17. Differenziamento osteogenico Acido ascorbico Desametasone ΒGlicerofosfato Osteoblasti MSCs

  18. Differenziamento condrogenico Acido ascorbico Insulina hTGFβ1 Poli- lisina Condrociti MSCs

  19. Sostenze bio-attive • Sostanze anti-apoptosi / citoprotettive • Antifibrotiche • Angiogenetiche • Mitotiche • ?????

  20. Dove sono le MSCs ? • Tessutoadiposo Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228. • Periostio • De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP: Human periosteum-derived cells maintain phenotypic stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age. Arthritis Rheum 2001, 44:85-95. • Membranasinoviale • De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP: Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 2001, 44:1928-1942. • Muscoli • Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummins J, Shuler T, Ghivizzani TC, Evans T, Robbins TD, Huard J: Osteoprogenitor cells within skeletal muscle. J Orthop Res 2000, 18:933-944. , • Derma • Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt J, Duenzl M, Lucas PA, Black AC: Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. AnatRec 2001, 264:51-62. • Midolloosseo • Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999, 284:143-147.

  21. Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo risalgono al 1970. Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore allontanò le cellule non aderenti. • Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da 3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare. Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla forma affusolata.

  22. MSC dal sangue periferico • La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico (PB-MSC) è ancora molto dibattuta. • La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa, tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in diverse condizioni patologiche, il numero di queste cellule aumenta. • Non è chiaro la loro origine né la loro funzione in vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli organi periferici al midollo ma non è chiaro se possano persistere nel sangue e costituire una popolazione staminale residente.

  23. Aspirato midollare • Il midollo osseo contiene tre tipi principali di cellule : endoteliali 0,1 % ematopoietiche 99,5% MSC 0,4%.

  24. Concentrazione dell’aspirato midollare • centrifugazione • filtrazione selettiva • concentrare la componente cellulare e portare il volume a 6-10 cc con un numero di cellule fino a 9 volte superiore rispetto all’aspirato midollare • ......ma da dove partiamo prima della concentrazione ?

  25. Il numero delle cellule • Il fattore piu’ importante !

  26. Quante sono le MSC presenti nel bacino del nostro paziente?

  27. Variabili • 1) Variabilità individuale Evento valutabile solo a posteriori dopo il prelievo • 2) Sede del prelievo in uno stesso individuo Bacino

  28. Variabili • 3) Traumi recenti nella sede del prelievo • “ consumo “ delle cellule 4) Malattie endocrine carenza estrogeni 5) Tabacco L’uso di tabacco influenza sicuramente la vitalità delle cellule mesenchimali e quindi il rischio di ottenere meno cellule deve essere tenuto presente . Non esistono al momento studi che mettano in rapporto il numero di sigarette fumate e il numero di MSCs

  29. Variabili • 6) Farmaci che influiscono sulla fisiologia del midollo osseo. Chemioterapici 7) Tumori in fase attiva In particolari per le neoplasie che elettivamente metastatizzano alle ossa. E´ noto come le cellule stromali mesenchimali tumorali (TDMC) che crescono accanto e frammiste alle CT in molte neoplasie possano essere parzialmente responsabili del loro sviluppo. L´interazione reciproca tra CT e lo stroma mesenchimale circostante è stata dimostrata nei tumori primari e nelle loro sedi metastatiche ed in particolare nelle ossa. Le TDMC forniscono un ambiente ottimale per la proliferazione delle TC grazie al reciproco scambio di molecole solubili e della matrice extracellulare, anche coinvolgendo cellule endoteliali e cellule della risposta immune. Il rischio di reclutare TDMC controindica questa procedura

  30. Variabili • 8) Abuso di alcool • 9) Età e sesso • Sono le variabili piu’ studiate . • E’ stata analizzata la popolazione di cellule mononucleate e dei progenitori degli osteoblasti presenti nel midollo osseo di individui di età differenti, suddivisi in maschi e femmine per studiare se il sesso e l’età possano influenzare la concentrazione cellulare.

  31. Variabili Numero delle MSC s maschi : decresce da 38 106 (30 aa) a 25.5 106 cells/ ml ( 70 aa) femmine : decresce da 56 106 (30 aa) a 19.5 106 cells/ml (70 aa). Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25

  32. E la funzione varia?

  33. La partita è finita ........ Grazie a tutti !!

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