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Introducción a la espectroscopía vibracional

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Introducción a la espectroscopía vibracional

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  1. Introducción a la espectroscopía vibracional • .Conceptos básicos • Estados vibracionales y energía • Modos normales de vibración • frecuencia de vibraciones • .Técnicas • Espectroscopía infrarroja • Regiones del IR • Grupos funcionales • "Huellas digitales" • Número de ondas e intensidad • Reglas de selección • FTIR y sus ventajas • Espectroscopía Raman • Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) • Reglas de selección • Ventajas sobre el IR • Resonanacia Raman • .Aplicaciones a proteínas • Análisis de estructura secundaria • Cálculos • Asignaciones • Uso de isótopos • Grupos laterales

  2. Bibliografía • Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984) • Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984). • Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180 • Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290 • Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

  3. Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético

  4. Estados vibracionales y energía Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlace F = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico

  5. O O C O O O O C C O O C Modos normales de vibración (3N - 5)

  6. Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección: No todas las vibraciones serán “activas” en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

  7. INFRARROJO

  8. INFRARROJO N-H C-H C=O

  9. FTIREspectrometría IR con Transformada de Fourier • Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. • Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez • Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1 • Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

  10. C H C N O C Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida) amida II (1567 F) amida III (1299 M) estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M) amida IV (627 D) amida V (725 F) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D)

  11. Estructura secundaria ovillo estadístico hélice a transición a  b b antiparalela Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967)242, 5460-5466

  12. Estructura secundaria Estructura a Estructura b Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957

  13. Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR

  14. Uso de isótopos 1H2O 2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

  15. Uso de isótopos Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6

  16. Uso de isótopos 1 = 27 min 2 = 63 min 3 = 180 min 4 = 21 h Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1 Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)

  17. Isótopos y posición de las bandas FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem.277:32867.

  18. Unión de ligandos

  19. estados electrónicos virtuales Técnicas: Raman Dispersión inelástica de fotones Sir Chandrasekhara Venkata Raman, (சந்திரசேகர வெங்கடராமன்) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888  Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930

  20. muestra Láser, luz monocromática Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Monocromador, espectrógrafo • Ventajas de Raman con respecto a IR • Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles • El agua produce una dispersión Raman muy débil • La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor

  21. N N

  22. Resonancia Raman estado electrónico excitado estado energético virtual Resonancia Raman Raman estado electrónico basal La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

  23. l = 406.7 nm Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem254(3): 662-70

  24. [hemo] = 0.34 mM [SO42-] = 400 mM SO42- Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338

  25. Uso de isótopos Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus l = 476 nm

  26. Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

  27. El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia) Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles El agua produce una dispersión Raman muy débil El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor Infrarrojo y Raman

  28. Introducción a la espectroscopía vibracional • .Conceptos básicos • Estados vibracionales y energía • Modos normales de vibración • frecuencia de vibraciones • .Técnicas • Espectroscopía infrarroja • Regiones del IR • Grupos funcionales • "Huellas digitales" • Número de ondas e intensidad • Reglas de selección • FTIR y sus ventajas • Espectroscopía Raman • Dispersión inelástica de fotones (Stokes y anti-Stokes) • Reglas de selección • Ventajas sobre el IR • Resonanacia Raman • .Aplicaciones a proteínas • Análisis de estructura secundaria • Cálculos • Asignaciones • Uso de isótopos • Grupos laterales