第五章 各类化学成分分析

1. 第五章各类化学成分分析

2. 讲授内容 • 第1节 生物碱类成分分析 • 第2节 黄酮类成分分析 • 第3节 三萜皂苷类成分分析 • 第4节 醌类成分分析 • 第5节 挥发性成分分析 • 第6节 木脂素类成分分析 • 第7节 其它类型成分分析

3. 第一节 生物碱类成分分析 • 概述 • 理化性质 • 鉴别 • 含量测定

4. 一、概述 • 生物碱是生物界除生物体必需的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。 • 含生物碱成分的常用中药：山豆根、制川乌、马钱子、延胡索、苦参、麻黄、黄连、黄柏、防己等

5. 麻黄碱 小檗碱 乌头碱 水苏碱

6. 二、理化性质 • 物理性状 • 溶解性 • 紫外光谱特征 • 显色反应

7. 物理性状 • 液体状的生物碱及个别小分子生物碱有挥发性甚至升华性 如：麻黄碱具有挥发性 咖啡因具有升华性 • 生物碱通常无色，但有长共轭结构，并有助色团的，可显不同颜色。如：小檗碱黄色

8. 溶解性 • 大多数生物碱难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂 • 与酸结合成盐生水溶性增加，但酸不同，生成的盐水溶性有差异 • 季胺型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水。

9. 溶解性 • 液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂 • 含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液

10. 沉淀反应 • 大多数生物碱在酸性水溶液可与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物。 酸性aq：KI-I2(棕红↓)；BiI3·KI (橘红～黄↓)；HgI2·2KI (类白↓)；硫氰酸铬铵(雷氏铵盐NH4[Cr(NH3)2(SCN)4](红↓) 中性：苦味酸(三硝基苯酚)(黄↓) • 中药水浸液中蛋白质、多肽和鞣质等成分，也可与生物碱沉淀试剂生成沉淀，需排除干扰，防止出现假阳性结果。 季铵盐↓剂

11. 显色反应 • 生物碱在一定pH条件下与一些酸性染料（多为磺酸肽类）生成有色配合物，可被氯仿等有机溶剂定量提出。 • 结构中具有酯键的酯碱，如：乌头碱可与异羟肟酸铁试剂反应产生紫红色

12. 紫外光谱特征 • 结构中具有共轭体系的生物碱均有紫外吸收。 • 结构中的氮原子与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置与测定时溶剂的pH值有关。

13. 三、鉴别 沉淀法 薄层色谱法 气相色谱法 高效液相色谱法 一般理化鉴别 色谱鉴别

14. 1薄层色谱法 • 吸附剂：硅胶、氧化铝 • 展开剂：多用氯仿、苯等低极性溶剂，加入其它溶剂调整展开剂的极性。（由于硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶板上能形成盐，使Rf值很小或拖尾，形成复斑。在硅胶吸附薄层中，常用碱性系统或在碱性环境下展开。） • 显色剂：改良碘化铋钾试剂，有时喷碘化铋钾试剂后再喷硝酸钠试剂，可使样品斑点更清晰；亦可用碘蒸气、硫酸铈、碘铂酸等。

15. 例：三妙丸中黄柏及小檗碱的鉴别(苍术、黄柏、牛膝)例：三妙丸中黄柏及小檗碱的鉴别(苍术、黄柏、牛膝) 取三妙丸粉末0.1g,加乙醚10ml，超声处理15分钟，滤过，弃去乙醚液，残渣加甲醇5ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1g，同制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液2ml、对照药材溶液与对照品溶液各1ml，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试剂(12∶6∶3∶3∶1)为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个黄色荧光斑点。

16. 2纸色谱法 • 可用于生物碱盐或游离碱的鉴别。 • 主要是以水为固定相的正相纸色谱法，分离效果常取决 于流动相的性质。BAW系统 • 显色剂：基本和薄层色谱法相同，但含硫酸的试剂不适用。

17. 3高效液相色谱法 • 依据：tR • 条件不同时，可已知品作内标，采用峰面积或峰高加大法 • 优点：快速，灵敏、微量等

18. 四、含量测定 • 生物碱的含量测定方法早期常用酸碱滴定法、沉淀滴定法等经典的化学方法，近年来多采用分光光度法、薄层色谱法及高效液相色谱法等 • （一）总生物碱的含量测定 • （二）生物碱类单体成分的含量测定

19. 酸碱滴定法 化学分析法 重量分析法 直接测定法 酸染料比色法 分光光度法 苦味酸盐比色法 离子对萃取比色法 雷氏盐比色法 异羟肟酸铁比色法 （一）总生物碱的含量测定 本法适用于处方药味较少、内成分较简单的中药制剂

20. 酸碱滴定分析法 返滴定法 • 强碱滴定生物碱盐时，在70％～90％的乙醇介质中终点比在水中明显，因此常将生物碱盐溶于70 ％ ～ 90％乙醇，再用标准碱-乙醇液滴定。 • 若选择的溶剂及指示终点方法合适，也可用非水滴定法进行。

21. 电位法 溴酚蓝 甲基红 水溶液中 指示终点方法 溴甲酚蓝 酚酞 指示剂 溴酚蓝 非水溶液 甲基黄 结晶紫 酸碱滴定分析法 净化-中性氧化铝；空白试验

22. 例 止喘灵注射液中总生物碱的含量测定—酸碱滴定法 处方 麻黄 洋金花 苦杏仁 连翘 方法 精密量取止喘灵注射液10ml，置分液漏斗中，加1mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，用三氯甲烷提取4次，（10ml、10ml、5ml、5ml）合并三氯甲烷液，置具塞锥形瓶中，精密加硫酸滴定液（0.01mol/L）10ml及新沸过的冷水10ml，充分振摇，加茜素黄酸钠指示剂1-2滴，用氢氧化钠滴定液（0.02mol/L）滴定至淡红色，并将滴定结果用空白实验校正。每1ml硫酸滴定液相当于3.305mg的麻黄碱（C10H15NO）。 变色范围：3.7～5.2黄→紫

23. 适用：混合碱、未知结构、M差异大 提取重量法 优点：简便、不用换算因数无需知M 缺点：挥发性、碱性条件下可水解生物碱不适用；取样大、操作易乳化、费时 重量分析法 优点：取样少、灵敏度高 沉淀法 缺点：计算复杂、操作繁琐 重量分析法

24. 例 昆明山海棠片中总生物碱成分的含量测定—重量法 处方 昆明山海棠取昆明山海棠片60片，除去糖衣，研细，取约相当于25片的量，精密称定，置200ml锥形瓶中，加适量硅藻土（每1g中加入硅藻±0.2g），混匀，加乙醇70ml，加热回流40分钟，放冷，滤过，滤渣再加乙醇50ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣加盐酸溶液（1→100）30ml，置水浴上搅拌使溶解，放冷，滤过，残渣再用盐酸溶液（1→200）同法提取3次（20ml、15ml、15ml），合并滤液溶于分液漏斗中，加氨试剂使溶液呈碱性，用乙醚振摇提取4次（40ml、30ml、25ml、25ml），合并乙醚液，用水振摇洗涤2次，每次10ml，乙醚液滤过，滤液置已在100℃干燥至恒重的蒸发皿中，在低温水浴上蒸去乙醚，残渣中加入少许无水乙醇，蒸干，在100℃干燥至恒重，称定重量，计算，即得。

25. 2分光光度法-直接测定法 • 不经过化学反应，利用生物碱物质自身的光吸收直接进行比色测定的方法。 • 一般用于药味较少，干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定。 如：戊己丸

27. （2）比色法 • 生物碱本身具有的颜色 • 与氧化剂产生颜色 • 因所具有的功能基与试剂反应产生颜色 • 根据生物碱的通性与酸性染料、雷氏盐、苦味酸盐等结合成有色化合物，并能溶于有机溶剂中的

28. 1）酸性染料比色法 • 应用本法的关键在于介质的pH、酸性染料的种类和有机溶剂的选择。 • 常用的酸性燃料：甲基橙 溴香草酚蓝（BTB） 溴甲酚绿等

29. 1）酸性染料比色法-基本原理

30. 1）酸性染料比色法 • pH的选择：根据染料的性质及生物碱的碱性（pKb）大小确定。一元5.2～6.4二元3.0～5.8 • 常用的酸性染料：甲基橙、溴香草酚蓝（BTB）、溴甲酚绿等 • 有机溶剂的选择原则：根据离子对与有机相能否形成氢键以及形成氢键能力的强弱，氯仿等是常用的提取溶剂。 • 在提取过程中，严防水分混入有机溶剂。

31. 例 风湿骨痛胶囊中乌头总生物碱的含量测定——酸性染料比色法 方法 对照品溶液制备 精密称取经1050C干燥至恒重的乌头碱对照品10mg，至100ml量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含乌头碱0.1mg）。

32. 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0 ml、1 ml、2 ml、3ml、4 ml、5 ml，分别置于分液漏斗中，依次精密加入三氯甲烷20ml，再精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液（称取无水醋酸钠0.15g，加水使溶解，加冰醋酸5.6ml，用水稀释至500ml，摇匀，并在pH计上校正）10ml和0.1%溴甲酚绿（取溴甲酚绿0.2g加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.2ml使溶解，用水稀释至200ml，摇匀）2 ml，强力振摇5分钟，静置20分钟，分取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，以相应试剂为空白，滤液照分光光度法，分别在412nm的波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

33. 测定法 取装量差异项下的内容物，研细，取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醚-三氯甲烷-无水乙醇（16∶8∶1）的混合溶液25ml和氨试液1.5ml，摇匀，称定重量，于快速混匀器上振荡三次，每次2分钟，放置过夜，称定重量，用上述混合溶液补足减失的重量，再于快速混匀器上振荡2分钟，静置，倾取上清液，精密量取5.0ml，置分液漏斗中，加乙醚5ml，用0.05mol/L的硫酸溶液提取4次，每次10ml，分取硫酸液，滤过，合并滤液，置另一分液漏斗中，

34. 加浓氨试剂4ml，摇匀，用三氯甲烷提取4次，每次10ml，分取三氯甲烷层，滤过，合并滤液，蒸干，残渣于105℃加热1小时，取出，放冷，加三氯甲烷分次溶解，转移至25ml量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取20ml，置分液漏斗中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10.00ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中乌头碱的量（μg/ml）计算，即得。加浓氨试剂4ml，摇匀，用三氯甲烷提取4次，每次10ml，分取三氯甲烷层，滤过，合并滤液，蒸干，残渣于105℃加热1小时，取出，放冷，加三氯甲烷分次溶解，转移至25ml量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，精密量取20ml，置分液漏斗中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入pH3.0醋酸盐缓冲液10.00ml”起，依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中乌头碱的量（μg/ml）计算，即得。

35. 该法为酸性染料分光光度法，其水相pH的选择是离子对萃取法取得成功与否的关键，风湿骨痛胶囊测定时的pH是分别取乌头碱标准液以pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2的缓冲液进行试验结果，表明以pH3.0较为适宜，在该条件下测定供试液吸收度较大，指示液空白试验吸收度较小，且呈色稳定性较好。该法为酸性染料分光光度法，其水相pH的选择是离子对萃取法取得成功与否的关键，风湿骨痛胶囊测定时的pH是分别取乌头碱标准液以pH2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2的缓冲液进行试验结果，表明以pH3.0较为适宜，在该条件下测定供试液吸收度较大，指示液空白试验吸收度较小，且呈色稳定性较好。

36. 2）苦味酸盐比色法 • 在弱酸性或中性溶液中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐沉淀，该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，也可以在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸。

37. 3）雷氏盐比色法 • 雷氏盐在酸性介质中可与生物碱类成分定量地生成难溶于水的有色合物。 • 将沉淀过滤洗净后溶于丙酮（或甲醇），直接比色法测定，换算成生物碱含量。 • 也可精密加入过量的雷氏盐试剂，滤除生成的生物碱雷氏盐沉淀，将滤液在520～526nm（溶于甲醇时，其λmax为427nm）处进行比色，测定残存的过量的雷氏盐含量，间接计算生物碱的含量。

38. 硫氰化铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数ε=106．5（单盐），故可根据其吸收值A按下式直接测定而不需绘制标准曲线。硫氰化铬铵在丙酮中的摩尔吸收系数ε=106．5（单盐），故可根据其吸收值A按下式直接测定而不需绘制标准曲线。 W一被测物重量（mg） M一被测物质的分子量 V一溶解沉淀所用丙酮的ml数

39. 雷氏盐比色法注意事项 • 雷氏盐的水溶液在室温可分解，故用时应新鲜配制，沉淀也需在低温进行 • 供试品如为稀的水溶液（如注射剂等），沉淀前应浓缩,对于中药制剂含有干扰物质时，应事先经过纯化处理 • 雷氏盐的丙酮或丙酮一水溶液的吸收值，随时间而有变化，故应尽快地测定。

40. 例 产妇康颗粒中益母草总生物碱的含量测定—雷氏盐比色法 处方 益母草 当归 人参 黄芪 何首乌 桃仁 蒲黄 熟地黄 香附 昆布 白术 黑木耳 对照品溶液制备 取盐酸水苏碱对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含1mg的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取装量差异下的内容物，研细，取12g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，精密量取续滤液25ml，置50ml烧杯中，置水浴上蒸干，精密加入0.1mol/L盐酸溶液10ml使溶解，即得。

41. 测定法 取上述对照品溶液和供试品溶液，各加活性炭0.5g，置水浴上加入1分钟，搅拌，滤过，滤液分别置25ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液10ml分次洗涤烧杯和滤器，洗涤液并入同一量瓶中；另取0.1mol/L盐酸溶液20ml置另一25ml量瓶中，作为空白溶液。各精密加新制的2%硫氰酸铬铵溶液3ml，摇匀，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，置冰浴中放置1小时，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在525nm的波长处分别测定吸收度，用空白溶液的吸收度分别减去对照品与供试品的吸收度，计算，即得。

42. 4）异羟肟酸铁比色法 • 含有酯键结构的生物碱，在碱性介质中加热，酯键水解，产生的羧基与羟胺反应生成异羟肟酸，再与Fe3＋生成紫红色的配合物（异羟肟酸铁），在一定浓度下符合Beer定律，可用比色法进行含量测定。

43. （二）生物碱类单体成分的含量测定 • 1薄层色谱法 • 2高效液相色谱法 • 3气相色谱法

44. 1薄层色谱法 • 生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定。 • 吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似，但要求比鉴别严格。 • 注意：使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂后（尤其在碱性环境下展开时）才可喷洒，否则背景深，反差小，影响测定。

45. 例 九分散中士的宁成分的含量测定—薄层扫描法 处方 马钱子粉 麻黄 乳香（制） 没药（制） 取本品约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加三氯甲烷20ml与浓氨试液1ml，轻轻摇匀，称重，于室温放置24小时，再称重，补足三氯甲烷减失的重量，充分振摇，滤过。精密量取续滤液10ml，用硫酸溶液（3→100）分次提取，至生物碱提尽，合并硫酸液，置另一分液漏斗中，加浓氨试液使呈碱性，用三氯甲烷分次提取，合并液，蒸干，放冷，残渣中精密加三氯甲烷5ml使溶解，作为供试品溶液。另取士的宁对照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯一丙酮一乙醇一浓氨试液（16∶12∶1∶4）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=254nm，λR=325nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。

46. 2高效液相色谱法 • 以反相高效液相色谱法应用较多。 • 在反相高效液相色谱中，由于硅胶表面残留硅羟基的影响，使生物碱分析易产生保留时间延长、峰形变宽、拖尾；可采取改进流动相、固定相等措施以克服游离硅羟基的影响，满足定量分析的要求。 • 中药制剂中生物碱成分进行高效液相色谱法测定时，使用较多的是紫外检测器。

47. 例 小孩清热止咳口服液中盐酸麻黄碱含量测定—高效液相色谱法 处方 麻黄、苦杏仁、石膏、甘草等 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)（3﹕97）为流动相；检测波长为205nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于4000。 对照品溶液的制备 取盐酸麻黄碱对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml含45µg 的溶液，即得。

48. 供试品溶液的制备 精密量取本品5ml，加水10ml及浓氨水0.5ml用乙醚提取5次（30ml，30ml，20ml，20ml，20ml），合并乙醚液，加盐酸乙醇溶液（1→20）2 ml，混匀，低温回收溶剂至干，残渣加乙醇5 ml使溶解，转移至25ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得。

49. 3气相色谱法 • 只适用于有挥发性、遇热不分解的生物碱类。 • 生物碱盐在急速加热过程中产生的酸对色谱柱和检测器不利，应该注意。 • 制备供试品溶液时一般采用冷提取，净化过程也要避免加热，以防止成分流失，最后需用氯仿等低极性有机溶剂为溶剂制备成供试液。

50. 第二节 黄酮类成分分析 • 概述 • 一般性质 • 鉴别 • 含量测定