设计短肽配基

1. 设计短肽配基 分离提纯质粒DNA新方法 报告人 屠依龙 报告时间 2012.10.12

2. 目录 1.研究背景 2.国内外研究进展 3.研究意义 4.研究目标及 拟解决问题 5.研究方法 技术手段 6.参考文献

3. 研究背景 基因疗法，DNA药物的广泛应用 病毒的不安全性 质粒的优势： 使用安全 易于转染 生产简易

4. 质粒合成与分离

5. 色谱法分离提纯

7. 色谱法分离提纯

8. 研究现状 短肽配基仿生设计 分子模拟现状

9. 研究现状——多肽配基设计 • 原理：乳糖操纵子DNA域（lacO）→乳糖阻遏蛋白（LacI） • LacI为DNA结合蛋白，结合域包括螺旋Ⅰ（6-12），转角，螺旋Ⅱ（17-25），螺旋Ⅲ（32-45），螺旋Ⅳ（50-58）。其中螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ形成HTH结构。 • LacI几乎不与RNA反应，固定化后依然具有生物活性

10. 分子模拟现状 • LacI通过与LacO特异性结合控制着乳糖代谢，与操纵子结合部位可分为O1、O2、O3三个部分。这三个部分功能不同，以O1为主，O2、O3为辅。最为重要的是中心的17对碱基对，以中间的G:C为中心形成伪倒序结构 。 • LacI-LacO结合部位的磁核共振建模已经成熟，有现成的对接模型 • 有研究者采用对比方法，比较了LacI头分别与O1、O2、O3的反应，发现与O1、O2都表现出良好的亲和性，而与O3形成额外的复合物，这可能与非特异性吸附有关。 • 有研究表明其中C端残基Arg50-Gly58形成枢纽区域。

11. 研究的目的及意义 研究意义： • 目前依然处于多肽配基研究的早期阶段，实验中常常套用蛋白分离的技术方法。虽然蛋白短肽配基已有所发展，但是质粒由于分子量大，空间位阻较大，作用更为复杂； • 多肽配基的合成成本高昂，肽链长度直接决定了合成成本，短肽一般6-8残基，成本将明显下降； • 亲合作用复杂，配基的寻找困难，而采用分子动力学模拟的方法将实验以模拟的形式进行，能大大减少实验量筛选出合适的配基。 研究目标： 设计寻找合适的短肽配基，摸索其吸附洗脱的条件， 验证配基稳定性，分离sc质粒获得高回收率和纯度。

12. 配基筛选 pDNA自主复制 连接介质 pDNA粗分离 静态吸附 洗脱条件实验 配基稳定性 实验室介质 得率、纯度 直接分离粗料液

13. pDNA粗液的制备 • pDNA自主复制：可采用质粒pUC19(0.01 lg/l, Invitrogen)转化大肠杆菌DH5α（此处可用其他现有质粒代替，只要含Lac操纵子即可），取50μL菌液放入50mL LB培养基中培养24h，温度保持37℃。活化后的菌株再依比例放大到500ml或1L培养基中。 • pDNA的提纯：制备质粒粗液收集500mL菌液至大离心管中，冷冻离心，4℃，4800rpm离心15min，弃上清。将沉淀重溶于18mL溶液I中。加入40mL新配置的溶液II，室温放置10min。加入20mL用冰预冷的溶液Ⅲ，缓缓颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，4℃冰箱放置10min。3047转头，4℃，4800rpm离心15min。将上清移至新离心管中，再次3047转头，4℃，4800rpm离心15min，重复操作两次。将上清过滤(用滤纸和漏斗)至新离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min。3047转头，室温下，4800rpm离心15min。弃上清，70％乙醇洗涤沉淀，#3047转头，室温下，4800rpm离心15min。3mLTE溶解沉淀，转移至40mL小离心管中。 采用promega公司质粒提取试剂盒和聚乙二醇纯化法制备质粒纯品。

14. 配基选择 • 配基的筛选：参考文献（Specificity and affinity of Lac repressor for the auxiliary operators O2 and O3 are explained by the structures of their protein-DNA complexes）所构造的LacI-LacO结合模型，通过rosetta软件进行分子动力学模拟。通过公司合成此配基，进行下一步实验。 • 配基连接：可采用商品化介质或实验室现有介质，，配基的合成包括了乙酰化以保证标准长度肽的N端包含Cys残基，因为Cys残基中的硫醇基能通过共轭作用来控制配基的固定化的方向。过程中可加入5%（体积）DMSO，能够增加小分子配基的溶解性能。

15. 静态吸附试验 进行三至五次平行实验，以减少操作误差 选用同一批介质，以减少介质造成误差 最佳吸附时间 检测方法：用分光光度计测量粗液、上清液、清洗液的核酸浓度，再通过物料平衡计算吸附量。（先用标准样品绘制标准曲线，然后用光度计测量A260/A280的比值，对比标准曲线可得其浓度） 最佳盐浓度 最佳pH值

16. 洗脱实验 填充色谱柱，进行浓度（或pH）梯度洗脱，可选择8个左右浓度跨度。色谱检验出峰情况，收集样品峰，用琼脂糖凝胶电泳检验其纯度，计算pDNA收率： pDNA收率=分离纯化后样品pDNA浓度×收集目标峰体积×pDNA纯度/纯化前样品pDNA浓度×上样粗品体积×100%。 非特异性结合实验：（选做） 此实验主要为了考察空白介质对pDNA的滞留作用（由所用介质的不同，作用原理不同，如静电作用，空间排阻作用等）。 采用不同浓度的pDNA与空白介质相互作用，然后与同水平的有配基的介质吸附水平做横向对比，所得结果分析其非特异性的结合所造成的误差。 洗脱流速：填充色谱柱，选择不同流速进行洗脱，流速可根据文献（如1 ml/min、2 ml/min、5 ml/min、10 ml/min）。然后通过比较不同流速下的样品峰图形，查看图形中峰的分离情况（主要是峰与峰之间是否有连带），选择分离效果最好的峰的流速。 洗脱时间：选定合适的洗脱流速，从色谱图中看目标样品峰完全分离所用的时间可知。 洗脱体积：得到了流速和洗脱时间便可计算出洗脱体积。 洗脱体积=洗脱流速×洗脱时间

17. 稳定性——短肽稳定性实验 化学药品缓冲液（蛋白变性剂） 浸泡24h，再将介质用TE缓冲液反复洗净，适宜条件下吸附，分光光度计测吸附量 修饰过的 介质

18. 稳定性——介质连接稳定性实验 吸附—洗脱—再生 计算每次pDNA的得率，前后比较，考察短肽配基结合介质之上的稳定性能。 填柱 修饰 （重复3-7次）

19. 扩展内容 • 与实验室现有介质 用实验室的介质如磁性介质或凝胶球，形成磁化床或制造整体住 • 直接分离裂解液 细胞破碎后的裂解液含大量杂质（宿主DNA、RNA、宿主蛋白、细胞壁物质、内毒素等），蛋白配基能够已成功处理了裂解液，而氨基酸配基由于特异性不强，无法直接处理。 短肽配基有比氨基酸更强的选择性，可尝试用之前实验所获得的配基直接处理裂解液，考察分离效果。 同时也要考虑介质问题

20. 谢谢观赏