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第七章 核酸的生物化学

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第七章 核酸的生物化学. Chapter 7 Biochemistry of Nucleic Acid. 第一节 核酸的结构与功能. Section 1 Structure and Function of Nucleic Acid. 细胞质 细胞 细胞核. 核酸 DNA  若干基因 组蛋白. 染色体 非组蛋白. What’s nucleic acid?. 核酸的发现: 1869 年瑞士米歇尔 核酸的定义:

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Presentation Transcript
slide1
第七章 核酸的生物化学

Chapter 7 Biochemistry of Nucleic Acid

slide2
第一节 核酸的结构与功能

Section 1 Structure and Function of Nucleic Acid

slide3

细胞质

细胞

细胞核

核酸DNA 若干基因

组蛋白

染色体

非组蛋白

What’s nucleic acid?

  • 核酸的发现:1869年瑞士米歇尔
  • 核酸的定义:

生物体内一类含有磷酸基团的重要生物大分子(酸性物质),是遗传变异的物质基础,是遗传信息的载体,在蛋白质的生物合成中起重要的作用。

slide4

核酸的分类:

  • 核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)

RNA主要参与遗传信息的表达;

  • 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)

DNA是遗传信息的载体;

  • RNA和DNA都是以单核苷酸(nucleotide)为基本单位所组成的多核苷酸长链。
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1.1 The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid

1.1 核酸的化学组成及一级结构

slide6

核糖

磷酸

戊糖

核酸

核苷酸

脱氧核糖

核苷

嘌呤碱

含氮碱

嘧啶碱

核酸的水解产物:

1 pyrimidine

N

H

O

O

2

4

5

N

3

C

H

N

H

H

N

N

3

6

2

O

N

N

O

O

N

N

H

H

H

1

尿嘧啶 胞嘧啶 胸腺嘧啶

Uracil,U Cytosine,C Thymine,T

1. 嘧啶碱(pyrimidine):

一、核苷酸中的碱基组成

2 purine

N

H

O

2

6

7

5

N

N

N

1

N

N

N

H

8

2

N

N

N

4

9

N

N

N

H

N

H

H

H

2

3

腺嘌呤(adenine, A)

鸟嘌呤(guanine, G)

2. 嘌呤碱(purine):
slide9

H

O

CH

O

H

2

O

O

H

O

H

-D-脱氧核糖(deoxyribose)

-D-核糖(ribose)

(构成DNA)

(构成RNA)

二、戊糖与核苷

1.戊糖(pentose):

2 nucleoside
2.核苷(nucleoside):
  • 核苷是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的化合物。
  • 在大多数情况下,核苷是由核糖或脱氧核糖的C1′-羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合,故生成的化学键称为,N糖苷键。
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OH

N1

N9

β1

β1

腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR)

β1,N9-糖苷键 β1,N1-糖苷键

slide12

2.核苷(nucleoside):

碱基和核糖的缩合物,以N-糖苷键相连;

  • 成苷位置:

核糖C-1与嘧啶N-1;

核糖C-1与嘌呤N-9。

  • 核苷:

腺苷A,鸟苷G,胞苷C,尿苷U;

  • 脱氧核苷:

脱氧腺苷dA,脱氧鸟苷dG,脱氧胞苷dC,脱氧胸苷dT;

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假尿苷(ψ)

1,C5-糖苷键

C5

1

  • “稀有核苷”是由“稀有碱基”所生成的核苷。
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三、核苷酸的结构与命名
  • 核苷酸(nucleotide)是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物,包括:
    • 核糖核苷酸: 5-AMP,5-GMP,5-CMP,5-UMP
    • 脱氧核糖核苷酸: 5-dAMP,5-dGMP,5-dCMP,5-dTMP
  • 与磷酸基缩合的位置:2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。
  • 最常见的核苷酸是5-核苷酸(5常被省略)
slide16
5-核苷酸又可按其在5位缩合的磷酸基的多少,分为一磷酸核苷(核苷酸)、二磷酸核苷和三磷酸核苷。5-核苷酸又可按其在5位缩合的磷酸基的多少,分为一磷酸核苷(核苷酸)、二磷酸核苷和三磷酸核苷。
slide17
环核苷酸的分子结构

环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷

slide19
细胞内游离核苷酸及其衍生物

1、含高能磷酸键的ATP类化合物;

  • ATP是能量的直接供体;
  • (脱氧)核苷三磷酸是合成RNA和DNA的原料;

ATP、GTP、CTP、TTP、UTP;

ADP、GDP、CDP、TDP、UDP;

  • 参加合成代谢;

UTP--糖类合成、GTP--蛋白质合成、CTP--脂类合成

2、环状核苷酸(cAMP、cGMP)

  • 第二信使,影响多种酶的活性
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四、核苷酸的性质
  • 一般物理性质 ;
  • 互变异构现象;
  • 紫外吸收,260nm ;
  • 核苷酸的两性解离和等电点 ;
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五、核酸的一级结构
  • 一分子核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键,从而将两分子核苷酸连接起来。
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5′端

C

A

G

3′端

多核苷酸链
  • 核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。
  • 核酸是的方向性:

多核苷酸链的两端,一端称为5-端,另一端称为3-端。

slide24

5′端

C

A

G

3′端

多核苷酸链简写方法
  • 书写方向规定为:

5-端→3-端。

slide25
核酸的一级结构

DNA分子:

  • 由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP组成。
  • DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式(3,5-磷酸二酯键)。

RNA分子:

  • 由AMP,GMP,CMP,UMP组成。
  • RNA的一级结构就是指RNA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。
slide26
核酸一级结构的表示方法

DNA的一级结构:

5-AGTCCATG-3 AGTCCATG

3-TCAGGTAC-5

RNA的一级结构:

5-AGUCCAUG-3 AGUCCAUG

slide27
核酸的水解作用
  • 水解方式:酶法、碱法和酸法

(1)碱水解

RNA2-核苷酸 + 3-核苷酸

DNA DNA变性但不被水解

(2)酸水解

DNA 无嘌呤的DNA分子 (pH4)

DNA(RNA)碱基+戊糖+磷酸(强酸高温)

slide28

核酸的水解作用

(3)核酸酶的水解作用

  • 核酸酶---水解核酸磷酸二酯键的酶
  • 种类
    • 根据底物不同分三类:

脱氧核糖核酸酶(DNase)

核糖核酸酶(RNase)

核酸酶(Nuclease)

    • 根据核酸酶对底物作用特点分

核酸内切酶、核酸外切酶

1 2 dna
1.2 DNA的空间结构与功能

1.2 Dimensional Structure and Function of DNA

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James Watson (L) and Francis Crick (R), and the model they built of the structure of DNA

一、DNA的二级结构——双螺旋结构模型
  • DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式,它是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型(获1962年度诺贝尔奖)。
slide31
(一)对DNA双螺旋结构模型作出贡献的科学家

1. Oswald Avery (1877-1955)

  • Microbiologist Avery led the team that showed that DNA is the unit of inheritance. One Nobel laureate has called the discovery "the historical platform of modern DNA research", and his work inspired Watson and Crick to seek DNA's structure.

—— Nature, 2003

slide32
2. Erwin Chargaff (1905-2002)
  • Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters, noticing that A matches to T and C to G. He later criticized molecular biology, the discipline he helped invent, as "the practice of biochemistry without a licence", and once described Francis Crick as looking like "a faded racing tout".

—— Nature, 2003

chargaff
Chargaff 研究小组的贡献
  • 1950~1953,Chargaff研究小组对DNA的化学组成进行了分析研究,发现:

① DNA碱基组成有物种差异,且物种亲缘关系越远,差异越大;

② 相同物种,不同组织器官中DNA碱基组成相同,而且不因年龄、环境及营养而改变;

③ DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性,即A=T、G=C、A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff规则。

slide34
3. Linus Pauling (1901-1994)
  • The titan of twentieth-century chemistry. Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules, and Watson and Crick saw him as their main competitor. In early 1953, working without the benefit of X-ray pictures, he published a paper suggesting that DNA was a triple helix.

—— Nature, 2003

slide35
4. Rosalind Franklin (1920-1958)
  • Franklin, trained as a chemist, was expert in deducing the structure of molecules by firing X-rays through them. Her images of DNA - disclosed without her knowledge - put Watson and Crick on the track towards the right structure. She went on to do pioneering work on the structures of viruses.

—— Nature, 2003

slide36
5. Maurice Wilkins (1916- )
  • Like Crick, New Zealand-born Wilkins trained as a physicist, and was involved with the Manhattan project to build the nuclear bomb. Wilkins worked on X-ray crystallography of DNA with Franklin at King's College London, although their relationship was strained. He helped to verify Watson and Crick's model, and shared the 1962 Nobel with them.

—— Nature, 2003

slide37
1953年由Franklin和Wilkins等人完成的研究工作,发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射,并证明DNA是一种螺旋构象。1953年由Franklin和Wilkins等人完成的研究工作,发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射,并证明DNA是一种螺旋构象。

Fig. 51

slide38
6. James Watson (1928- )
  • Watson went to university in Chicago aged 15, and teamed up with Crick in Cambridge in late 1951. After solving the double helix, he went on to work on viruses and RNA, another genetic information carrier. He also helped launch the human genome project, and is president of Cold Spring Harbor Laboratory in New York.

—— Nature, 2003

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7. Francis Crick (1916-2004 )
  • Crick trained and worked as a physicist, but switched to biology after the Second World War. After co-discovering the structure of DNA, he went on to crack the genetic code that translates DNA into protein. He now studies consciousness at California's Salk Institute.

—— Nature, 2003

slide40
典型的双链DNA 二级结构
  • DNA右手双螺旋结构模式的设计者:

Watson与Crick,1953年。

  • 设计主要依据:

(1)对DNA分子X射线衍射图分

(2)碱基摩尔含量的比率关系

(3)四种碱基的理化数据分析

slide41
(二)DNA双螺旋结构模型的要点:
  • 目前已知DNA双螺旋结构可分为:
  • A、B、C、D(右手双螺旋)
  • Z型(左手双螺旋)
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(二)DNA双螺旋结构模型(B型)的要点:

(1) 两条反向平行的多核苷酸链围绕同一中心轴形成右旋的双螺旋结构。

(2) 碱基位于双螺旋的内侧,磷酸和核糖在外侧;

(3) 碱基配对原则: A=T(2),G=C(3);

(4) 螺旋参数:每螺旋10对,螺距3.4nm;

(5) 小沟,大沟;

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(二)DNA双螺旋结构模型(B型)的要点:

(6) 螺旋的稳定因素:

  • 氢键
  • 碱基堆积力

碱基对平面垂直于中心轴,层叠于双螺旋的内侧.疏水性碱基堆积在一起相互吸引形成碱基堆积力。

  • 离子键

DNA分子的大小:碱基对(bp)、分子量

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(二)DNA双螺旋结构模型的要点:
  • 目前已知DNA双螺旋结构可分为:
  • A、B、C、D(右手双螺旋)
  • Z型(左手双螺旋)
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二、DNA的三级超螺旋结构及在染色质中组装
  • 超螺旋结构(superhelix 或supercoil)

DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。

    • 正超螺旋(positive supercoil)

盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。

    • 负超螺旋(negative supercoil)

盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。

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(一)原核生物DNA的高级结构:

  • 绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋结构。
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(二)DNA在真核生物细胞核内的组装:
  • 在真核生物中,双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕,从而形成特殊的串珠状结构,称为核小体(nucleosome)。核小体结构属于DNA的高级结构。
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三、DNA的功能
  • DNA的基本功能是作为遗传信息的载体,为生物遗传信息复制以及基因信息的转录提供模板。
slide54
DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因(gene)。DNA分子中具有特定生物学功能的片段称为基因(gene)。
  • 一个生物体的全部DNA序列称为基因组(genome)。
  • 基因组的大小与生物的复杂性有关,如病毒SV40的基因组大小为5.1×103bp,大肠杆菌为5.7×106bp,人为3.2×109bp。
1 3 rna
1.3 RNA的结构与功能

1.3 Structure and Function of RNA

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一、RNA的种类、分布与功能
  • RNA在蛋白质生物合成过程中起着重要的作用
    • RNA通常以单链形式存在,但也可形成局部的双螺旋结构。
    • RNA分子的种类较多,分子大小变化较大,功能多样化。
    • 主要的RNA种类有rRNA、mRNA、tRNA、HnRNA、SnRNA、SnoRNA、ScRNA等。
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一、RNA的种类、分布与功能

(1)细胞质中的RNA

  • 核糖体RNA(ribosomal RNA, rRNA)
  • 转运RNA(transfer RNA ,tRNA)
  • 信使RNA(message RNA, mRNA)
  • 小胞浆RNA(scRNA, small cytosol RNA)
  • 线粒体RNA
  • 叶绿体RNA

(2)细胞核中的RNA

  • hnRNA(heterogeneous nuclear RNA)不均一RNA
  • snRNA(small nuclear RNA),小核RNA;
  • chRNA(chromosome RNA),染色体RNA;

(3)病毒RNA

mrna rrna trna
mRNA、 rRNA 、 tRNA的功能
  • mRNA分子中带有遗传密码,其功能是为蛋白质的合成提供模板(templet)。

mRNA分子中每三个相邻的核苷酸组成一组,在蛋白质翻译合成时代表一个特定的氨基酸,这种核苷酸三联体称为遗传密码(coden)。

  • rRNA是细胞中含量最多的RNA,占总量的80%。rRNA与蛋白质一起构成核蛋白体,作为蛋白质生物合成的场所。
  • tRNA在蛋白质的生物合成过程中转运氨基酸。
slide60
二、tRNA的结构
  • tRNA是分子最小,但含有稀有碱基最多的RNA,其稀有碱基的含量可多达20%。
  • tRNA是保守性最强的RNA。
  • tRNA是单链核酸,但其分子中的某些局部也可形成双螺旋结构。
slide61
(一)tRNA的二级结构:
  • tRNA的二级结构由于局部双螺旋的形成而呈现“三叶草”形,故称为“三叶草”结构。
  • tRNA的“三叶草”形结构包括:

氨基酸臂、DHU臂、反密码臂、可变臂和TψC臂五部分。

  • 靠氢键维持稳定性。
slide62

氨基酸臂

DHU臂

携带氨基酸

辨认并结合氨基酰tRNA合成酶

反密码臂

TC臂

可变臂

识别mRNA上的密码

识别并结合核蛋白体

trna l

氨基酸接受臂与反密码子环分别位于两端;

  • 分子上有两个双螺旋区;
  • 构象靠非螺旋区的碱基之间的氢键维持。
(二)tRNA的三级结构(倒L型):
slide64

例题:1 双链DNA分子量为3×107,

计算:a DNA的长度

b 含多少圈螺旋

c 分子的长度

(每对核苷酸残基平均分子量为618)

解:a L= 3×107/618 ×0.34

b n= 3×107/618 ÷10

c V=3.14 ×1.02 × 3×107/618 ×0.34

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例题2: 已知某DNA溶液,碱基A占16%, 求其余碱基所含的比例。

解:因为,A=T,G=C

所以,T=A=16%

G=C=50%-16%=34%

例题3:已知DNA分子的一条链碱基顺序为:3’GCTACGA, 写出其互补链的碱基顺序。

slide66
第二节 核酸的理化性质、变性和复性及其应用

Section 2 The Physical and Chemical Characters, Denaturation and Renaturation of Nucleic Acid, as well as their Applications

slide67

一、核酸的一般理化性质

  • 两性解离 / 一般呈酸性(在中性溶液中带负电荷),
  • 微溶于水,不溶于有机溶剂
  • 线性大分子(粘度高, 抗剪切力差)
  • 可用电泳或离子交换(色谱)进行分离
  • 室温条件下,DNA在碱中变性,但不水解,RNA水解
  • 加热条件下,D-核糖+浓盐酸+苔黑酚 绿色
  • D-2-脱氧核糖+酸+二苯胺 蓝紫色
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二、核酸的紫外吸收特性

1、紫外吸收性质

max=260nm

2、应用

  • 以A260/A280进行定性、定量及纯度测定:

纯DNA: A260/A280>1.8

纯RNA : A260/A280>2.0

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二、核酸的紫外吸收特性

1、紫外吸收性质

max=260nm

2、应用

  • 以A260/A280进行定性、定量及纯度测定:

纯DNA: A260/A280>1.8

纯RNA : A260/A280>2.0

  • DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭(EB),在紫外下发出荧光
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二、核酸的紫外吸收特性

1、紫外吸收性质

max=260nm

2、应用

  • 以A260/A280进行定性、定量及纯度测定:

纯DNA: A260/A280>1.8

纯RNA : A260/A280>2.0

  • DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭(EB),在紫外下发出荧光
  • 减色效应
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三、DNA的变性
  • 天然核酸在理化因素作用下,其双螺旋的氢键断裂,碱基堆积力不再存在,DNA双螺旋的两条互补链松散而分开成为无规则线团状的单链DNA单链现象称为DNA的变性(denaturation)。
  • 引起DNA变性的因素:

①高温,②强酸强碱,③有机溶剂等。

slide72

DNA变性后的性质改变:

① 增色效应(hyperchromic effect):指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象;

② 旋光性下降;

③ 粘度降低;

④ 生物学功能丧失或改变。

slide73

DNA的变性温度

  • 加热DNA溶液,使其对260nm紫外光的吸收度突然增加,达到其最大值一半时的温度,就是DNA的变性温度(融解温度,melting temperature, Tm)。
slide74
Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关,G+C的含量越高,则Tm越高。Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关,G+C的含量越高,则Tm越高。
slide75
四、DNA的复性与分子杂交
  • 将热变性后的DNA溶液缓慢冷却,在低于变性温度约25~30℃的条件下保温一段时间(退火annealing),则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。
  • 将变性DNA经退火处理,使其重新形成双螺旋结构的过程,称为DNA的复性。
slide76

DNA的复性

  • DNA复性后,一系列性质将得到恢复,但是生物活性一般只能得到部分的恢复,具有减色效应。
  • 将热变性的DNA骤然冷却至低温时,DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性,因此又称为“退火”。

退火温度=Tm-25℃

  • 复性影响因素

片段浓度/片段大小/片段复杂性(重复序列数目)/ 溶液离子强度

slide77

核酸的分子杂交(hybridization)

  • 两条来源不同的单链核酸(DNA或RNA),只要它们有大致相同的互补碱基顺序,经退火处理即可复性,形成新的杂种双螺旋,这一现象称为核酸的分子杂交(hybridization)。
slide78
核酸杂交可以是DNA-DNA,也可以是DNA-RNA杂交。
  • 不同来源的,具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序(homologous sequence)。
dna dna

复性

变性

不同来源的DNA分子

DNA-DNA

杂交双链分子

DNA-DNA杂交示意图
slide81
利用核酸的分子杂交,可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。利用核酸的分子杂交,可以确定或寻找不同物种中具有同源顺序的DNA或RNA片段。
  • 常用的核酸分子杂交技术有:原位杂交、斑点杂交、Southern杂交及Northern杂交等。
1 2 dna 1 2
五、核酸的含量与纯度测定(一)核酸含量的测定1、定磷法2、定糖法(二)DNA纯度的鉴定1、紫外吸收2、凝胶电泳五、核酸的含量与纯度测定(一)核酸含量的测定1、定磷法2、定糖法(二)DNA纯度的鉴定1、紫外吸收2、凝胶电泳
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六、核酸的分离、纯化

(一)核酸的工业化生产

(二)活性核酸的制备

注意一般原则:

  • 低温(0-4℃),避免强酸、强碱和剧烈搅拌;
  • 抑制核酸酶的作用;
  • 用有机溶剂抽提以去除蛋白;
  • 乙醇沉淀;
slide84
第三节 核苷酸代谢

Section 3 Metabolism of nucleotides

slide85
核苷酸(nucleotide)是构成核酸(nucleic acid)的基本单位,人体所需的核苷酸都是由机体自身合成的。
  • 食物中的核酸或核苷酸类物质基本上不能被人体所利用。 在核酸类物质的水解产物中,只有磷酸和戊糖可被吸收利用。
slide86

蛋白质

磷酸

核蛋白

小肠

小肠

HCl

核酸

单核苷酸

戊糖

小肠

胰核酸酶

核苷酸酶

核苷

核苷酶

含氮碱

食物中核酸的消化

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3.1 嘌呤核苷酸的代谢

3.1 Metabolism of Purine Nucleotides

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一、嘌呤核苷酸的合成代谢
  • 通过利用一些简单的前体物,如5-磷酸核糖,氨基酸,一碳单位及CO2等,逐步合成嘌呤核苷酸的过程称为从头合成途径(de novo synthesis)。
  • 这一途径主要见于肝,其次为小肠和胸腺。 所有合成反应在胞液中进行。

(一)嘌呤核苷酸的从头合成:

slide89

CO2

甘氨酸

天冬氨酸

甲酰基

(N5,N10-CH=FH4)

甲酰基

(N10-CHO FH4)

谷氨酰胺

(酰胺基)

嘌呤碱合成的元素来源

slide90
嘌呤核苷酸合成途径:

1、5’-磷酸核糖活化为——

5’-磷酸核糖-1’-焦磷酸(PRPP)

2、IMP的合成

3、由IMP转变成AMP,GMP

slide91

1.从头合成途径:

⑴ 次黄苷酸的合成:

  • 首先在磷酸核糖焦磷酸合成酶的催化下,消耗ATP,由5-磷酸核糖合成PRPP(1-焦磷酸-5-磷酸核糖)。
  • PRPP再经过大约10步反应,合成第一个嘌呤核苷酸——次黄苷酸(IMP)。
slide92

ATP

AMP

R-5-P

(5-磷酸核糖)

PRPP

(5-磷酸核糖-1-焦磷酸)

PRPP合成酶

在谷氨酰胺、甘氨酸、一碳单位、二氧化碳及天冬氨酸的参与下,逐步合成

IMP

次黄苷酸(IMP)的合成

  • 合成过程
slide94
⑵ 腺苷酸及鸟苷酸的合成:
  • IMP在腺苷酸代琥珀酸合成酶的催化下,由天冬氨酸提供氨基合成腺苷酸代琥珀酸(AMP-S),然后裂解产生腺苷酸(AMP)。
  • IMP也可在IMP脱氢酶的催化下,以NAD+为受氢体,脱氢氧化为黄苷酸(XMP),后者再在鸟苷酸合成酶催化下,由谷氨酰胺提供氨基合成鸟苷酸(GMP)。
amp gmp

延胡索酸

GDP + Pi

AMP-S

AMP

Asp + GTP

腺苷酸代琥

珀酸裂解酶

腺苷酸代琥

珀酸合成酶

IMP

IMP脱氢酶

鸟苷酸合成酶

H2O + NAD+

GMP

XMP

NADH + H+

Gln + ATP

Glu + AMP + PPi

腺苷酸(AMP)与鸟苷酸(GMP)的合成
slide96

核苷单磷酸激酶

核苷二磷酸激酶

ATP/GTP

ADP/GDP

AMP/GMP

ATP

ATP

ADP

ADP

合成RNA

NADPH+H+

核糖核苷酸还原酶

NADP++H2O

核苷二磷酸激酶

dATP/dGTP

dADP/dGDP

ATP

ADP

合成DNA

⑶ 三磷酸嘌呤核苷的合成:

slide97

核糖核苷酸还原酶

dNDP + H2O

NDP

还原型硫氧

化还原蛋白

氧化型硫氧

化还原蛋白

S

SH

S

SH

NADP+

NADPH + H+

硫氧化还原蛋白还原酶

(FAD)

核糖核苷酸还原酶的作用机制
slide98

(二)嘌呤核苷酸的补救合成:

  • 又称再利用合成途径(salvage pathway)。指利用分解代谢产生的自由嘌呤碱合成嘌呤核苷酸的过程。
  • 这一途径可在大多数组织细胞中进行。
slide99

腺嘌呤磷酸核糖转移酶

A + PRPP

AMP + PPi

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶

I/G+PRPP

IMP/GMP+PPi

嘌呤核苷酸的补救合成过程

slide100
二、嘌呤核苷酸的分解代谢
  • 嘌呤核苷酸的分解首先是在核苷酸酶的催化下,脱去磷酸生成嘌呤核苷,然后再在核苷酶的催化下分解生成嘌呤碱,最后在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化生成尿酸(uric acid),再经尿液排出体外。
slide101

核苷酸酶

核苷酶

脱氨酶

次黄嘌呤

次黄苷

AMP

腺苷

H2O

H2O

Pi

R-1-P

NH3

Pi

黄嘌呤

氧化酶

鸟嘌呤酶

核苷酸酶

核苷酶

黄嘌呤

鸟嘌呤

鸟苷

GMP

NH3

H2O

H2O

R-1-P

Pi

Pi

嘌呤核苷酸的分解

尿酸

slide102
尿酸是嘌呤核苷酸在人体内分解代谢的终产物。但在鸟类,尿酸则可继续分解产生尿囊素。尿酸是嘌呤核苷酸在人体内分解代谢的终产物。但在鸟类,尿酸则可继续分解产生尿囊素。
  • 正常人血浆中尿酸含量约为0.12~0.36mmol/L(2~6mg%)。
  • 尿酸水溶性较差,当血浆中尿酸含量超过8mg%时,即可形成尿酸盐晶体。
slide103
痛风症患者由于体内嘌呤核苷酸分解代谢异常,可致血中尿酸水平升高,以尿酸钠晶体沉积于软骨、关节、软组织及肾,临床上表现为皮下结节,关节疼痛等。痛风症患者由于体内嘌呤核苷酸分解代谢异常,可致血中尿酸水平升高,以尿酸钠晶体沉积于软骨、关节、软组织及肾,临床上表现为皮下结节,关节疼痛等。
  • 临床上常用别嘌呤醇(allopurinol)治疗痛风症。
slide104

鸟嘌呤

黄嘌呤

尿酸

次黄嘌呤

痛风症的治疗机制

黄嘌呤氧化酶

黄嘌呤氧化酶

别嘌呤醇

slide105
别嘌呤醇的分子结构与次黄嘌呤类似,可竞争性抑制黄嘌呤氧化酶的活性,从而减少体内尿酸的生成。别嘌呤醇的分子结构与次黄嘌呤类似,可竞争性抑制黄嘌呤氧化酶的活性,从而减少体内尿酸的生成。
  • 同时,别嘌呤与PRPP反应生成的别嘌呤核苷酸,可反馈抑制嘌呤核苷酸从头合成途径的关键酶。
slide106
3.2 嘧啶核苷酸的代谢

3.2 Metabolism of Pyrimidine Nucleotides

slide107
一、嘧啶核苷酸的合成代谢
  • 嘧啶核苷酸从头合成途径(de novo synthesis)是指利用氨基酸、CO2等简单前体物逐步合成嘧啶核苷酸的过程。
  • 该合成过程主要在肝细胞的胞液中进行。

(一)嘧啶核苷酸的从头合成:

slide108

C4

Gln→

N3

C5

|

氨基甲酰磷酸

←Asp

CO2→

C2

C6

N1

嘧啶合成的元素来源

slide109

氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ

Gln + CO2

氨基甲酰磷酸 + Glu

2ATP

2ADP + Pi

1. 从头合成途径的反应过程:

⑴ 尿苷酸的合成:

  • 在氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ的催化下,以Gln,CO2,ATP为原料合成氨基甲酰磷酸。
slide111
氨基甲酰磷酸在天冬氨酸转氨甲酰酶的催化下,转移一分子天冬氨酸,从而合成氨甲酰天冬氨酸,然后再经脱氢、脱羧、环化等反应,合成第一个嘧啶核苷酸,即UMP。 氨基甲酰磷酸在天冬氨酸转氨甲酰酶的催化下,转移一分子天冬氨酸,从而合成氨甲酰天冬氨酸,然后再经脱氢、脱羧、环化等反应,合成第一个嘧啶核苷酸,即UMP。 
slide113

核苷单磷

酸激酶

核苷二磷

酸激酶

CTP合成酶

CTP

UTP

UMP

UDP

ATP

ADP

ATP

Gln+ATP

Glu+ADP+Pi

ADP

合成RNA

⑵ 胞苷酸的合成:

slide114

核糖核苷酸还原酶

磷酸酶

核苷二磷酸激酶

dCDP

dCTP

CDP

CTP

H2O Pi

NADPH+H+ NADP++H2O

ATP ADP

H2O

磷酸酶

Pi

合成DNA

dCMP

H2O

脱氨酶

核糖核苷

酸还原酶

磷酸酶

NH3

dTTP

UDP

dUDP

dUMP

N5,N10-CH2-FH4

核苷二磷

酸激酶

胸苷酸合酶

FH2

dTMP

dTDP

核苷单磷酸激酶

⑶ 脱氧嘧啶核苷酸的合成:
slide115

尿苷胞苷激酶

UMP/CMP

尿苷/胞苷

ATP ADP

脱氧胸苷激酶

TdR

dTMP

ATP ADP

(二)嘧啶核苷酸的补救合成:

  • 由分解代谢产生的嘧啶/嘧啶核苷转变为嘧啶核苷酸的过程称为补救合成途径 (salvage pathway)。以嘧啶核苷的补救合成途径较重要。
slide116

核苷磷酸化酶

核苷酸酶

嘧啶核苷酸

嘧啶核苷

嘧啶碱

1-磷酸核糖

Pi

H2O

Pi

二、嘧啶核苷酸的分解代谢
  • 嘧啶核苷酸可首先在核苷酸酶和核苷磷酸化酶的催化下,除去磷酸和核糖,产生的嘧啶碱可在体内进一步分解代谢。
slide117
嘧啶碱的降解过程主要在肝细胞中进行。
  • 不同类型的嘧啶碱,其分解代谢的途径和终产物不同。
slide118

二氢尿嘧啶脱氢酶

胞嘧啶脱氨酶

二氢嘧啶酶

二氢

尿嘧啶

尿嘧啶

胞嘧啶

-脲基丙酸

NADPH+H+ NADP+

H2O NH3

H2O

H2O

-脲基丙酸酶

NH3 + CO2

尿素

丙二酸单酰CoA

乙酰CoA

-丙氨酸

TAC

(一)胞嘧啶和尿嘧啶的降解

slide119

二氢胸腺嘧

啶脱氢酶

二氢嘧啶酶

二氢胸

腺嘧啶

胸腺嘧啶

-脲基异丁酸

NADPH+H+ NADP+

H2O

H2O

-脲基异丁酸酶

NH3 + CO2

尿素

TAC

甲基丙二酸

单酰CoA

琥珀酰CoA

-异丁酸

糖异生

(二)胸腺嘧啶的降解
slide120
基因信息的传递
  • DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子,是遗传信息的携带者。
  • 生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。
slide121
DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代;通过转录和翻译,将遗传信息传递给蛋白质分子,从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代;通过转录和翻译,将遗传信息传递给蛋白质分子,从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。
slide122
在RNA病毒中,其遗传信息贮存在RNA分子中。因此,在这些生物体中,遗传信息的流向是RNA通过复制,将遗传信息由亲代传递给子代,通过反转录将遗传信息传递给DNA,再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质,这种遗传信息的流向就称为反中心法则。在RNA病毒中,其遗传信息贮存在RNA分子中。因此,在这些生物体中,遗传信息的流向是RNA通过复制,将遗传信息由亲代传递给子代,通过反转录将遗传信息传递给DNA,再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质,这种遗传信息的流向就称为反中心法则。
slide123

蛋白质

RNA

DNA dependent DNA polymerase——DDDP

DNA dependent RNA polymerase——DDRP

RNA dependent RNA polymerase——RDRP

RNA dependent DNA polymerase——RDDP

复制(DDDP)

转录(DDRP)

翻译

DNA

反转录(RDDP)

RNA

复制(RDRP)

section 4 dna biosynthesis replication
Section 4 DNA Biosynthesis, Replication

第四节 DNA的生物合成(复制)

slide125
4.1 复制的基本规律

4.1 Basic Rules of DNA Replication

slide126

一、半保留复制

  • DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板,合成完全相同的两个双链子代DNA,每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链,这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。
slide127

复制

亲代DNA

子代DNA

DNA半保留复制示意图

slide128

DNA半保留复制的实验证明

  • DNA以半保留方式进行复制,是在1958年由M. Meselson和 F. Stahl 所完成的实验所证明。
  • 该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代,使其DNA中的碱基氮均转变为15N。然后将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA,作密度梯度离心,将具有不同密度的DNA分离开。
slide130

半保留复制的意义

  • 按半保留复制方式,子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致,即子代保留了亲代的全部遗传信息,体现了遗传的保守性。
  • 遗传的保守性,是物种稳定性的分子基础,但不是绝对的。
slide131

二、有一定的复制起始点

  • DNA在复制时,需在特定的位点起始,这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点(origin)。
  • 在原核生物中,复制起始点通常为一个,而在真核生物中则为多个。
slide133
习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离(或DNA片段)定为一个复制子(replicon)
  • 复制子是独立完成复制的功能单位。
  • DNA复制时,局部双螺旋解开形成两条单链,这种叉状结构称为复制叉。
slide134

ori

ori

ori

ori

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

复制子

复制起始点与复制子示意图

slide136

三、需要引物

  • 参与DNA复制的DNA聚合酶,必须以一段具有3’端自由羟基(3’-OH)的RNA作为引物(primer) ,才能开始聚合子代DNA链。
  • RNA引物的大小,在原核生物中通常为50~ 100个核苷酸,而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序,与其模板DNA的碱基顺序相配对。
slide137

复制中的放射自显影图象

四、双向复制

  • DNA复制时,以复制起始点(origin)为中心,向两个方向进行解链,形成两个延伸方向相反的复制叉,称为双向复制(bidirectional replication)。
  • 但在低等生物中,也可进行单向复制(如滚环复制)。
slide138

ori

A B C

ter

DNA的双向复制示意图

A. 环状双链DNA及复制起始点

B. 复制中的两个复制叉

C. 复制接近终止点(termination, ter)

slide139

五、半不连续复制

  • DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链,即模板DNA链的方向必须是3'→5'。
  • 由于DNA分子中两条链的走向相反,因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时,子代链的聚合方向也是不同的。
slide140

3

5

解链方向

3

5

DNA的半不连续复制

领头链

(leading strand)

随从链

(lagging strand)

slide141
以3’→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的,其子代链的聚合方向为5’→3’,这一条链被称为领头链(leading strand)。
  • 以5’→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的,其链的聚合方向也是5’→3’,这条链被称为随从链(lagging strand)。
  • 领头链连续复制而随从链不连续复制,就是复制的半不连续性。
slide142
由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的,因此,随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时,由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。
  • 冈崎片段的大小,在原核生物中约为1000~2000个核苷酸,而在真核生物中约为100个核苷酸。
slide143
2.2 Factors for DNA Replication

2.2 DNA复制的条件

substrate

(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 +PPi

一、底物(substrate)
  • 以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物,即dATP,dGTP,dCTP,dTTP。
slide146

二、模板(template)

  • DNA复制是模板依赖性的,必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后,可分别作为模板进行复制。
slide147

三、引发体和RNA引物

  • 引物酶(primerase)本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP),该酶以DNA为模板,聚合一段RNA短链引物(primer),以提供自由的3’-OH,使子代DNA链能够开始聚合。
  • 引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。
slide148
在E. coli中,含有解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域的复合结构被称为引发体(primosome)。
slide149

Dna B Dna C

3

Dna A

引物酶

5

3

DNA拓扑异构酶

SSB

5

引发体的组装形成

含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

slide150

3

5'

3' HO

5

3

5

引物酶催化合成短链RNA引物分子

引物酶

引物

slide151
四、DNA聚合酶

全称:依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP )

简称:DNA-pol

活性:1. 53的聚合酶活性

2. 核酸外切酶活性

slide152

5´ A G C T T C A G G A T A 3´

| | | | | | | | | | |

3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´

DNA聚合酶的核酸外切酶活性

?

  • 3 5外切酶活性

能辨认错配的碱基对,并将其水解。

  • 5 3外切酶活性

能切除突变的 DNA片段。

slide153

(一)种类和生理功能:

  • 在原核生物中,目前发现的DNA聚合酶有三种,分别命名为DNA聚合酶Ⅰ(pol Ⅰ),DNA聚合酶Ⅱ(pol Ⅱ),DNA聚合酶Ⅲ(pol Ⅲ),这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。
  • 参与DNA复制的主要是pol Ⅲ和pol Ⅰ。
slide154
pol Ⅰ为具有三种酶活性的单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段,其中的大片段保留了两种酶活性,即5'→3'聚合酶和3'→5'外切酶活性,通常被称为Klenow fragment。

Klenow片段的分子结构

slide155
pol Ⅲ由十种亚基组成不对称异源二聚体结构,其中亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性,具有复制DNA的功能;而亚基具有3'→5'外切酶的活性,与DNA复制的校正功能有关。
slide157

DNA-pol 

起始引发,有引物酶活性。

DNA-pol 

参与低保真度的复制 。

DNA-pol 

在线粒体DNA复制中起催化作用。

DNA-pol 

延长子链的主要酶,有解螺旋酶活性。

DNA-pol 

在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

  • 在真核生物中,目前发现的DNA聚合酶有五种:
slide159

(二)DNA复制的保真性(fidelity):

  • 为了保证遗传的稳定,DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关:

1.遵守严格的碱基配对规律;

2.DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择;

3.对复制过程中出现的错误及时进行校正。

dna pol
DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

A:DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基;并用其聚合酶活性掺入正确配对的底物。

B:碱基配对正确, DNA-pol不表现外切酶活性。

slide161

五、DNA连接酶

  • DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成,从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。
slide162

5’

3’

3’

HO

5’

ATP(NAD+)

DNA连接酶

ADP+Pi(NMN++AMP)

5’

3’

3’

5’

DNA连接酶的连接作用

slide163
DNA连接酶催化的条件是:

① 需一段DNA片段具有3'-OH,而另一段DNA片段具有5'-Pi基;

② 未封闭的缺口位于双链DNA中,即其中有一条链是完整的;

③ 需要消耗能量,在原核生物中由NAD+供能,在真核生物中由ATP供能。

slide164

DNA连接酶的作用

  • DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。
  • 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。
  • 是基因工程的重要工具酶之一。
slide165

六、解螺旋酶

  • 解螺旋酶(helicase),又称解链酶或rep蛋白,是用于解开DNA双链的酶蛋白。
  • 每解开一对碱基,需消耗2分子ATP。
slide166

七、单链DNA结合蛋白

  • 单链DNA结合蛋白(single strand binding protein, SSB),又称螺旋反稳蛋白(HDP),是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。
slide167
SSB的生理作用
  • 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在,即稳定单链DNA,便于其作为模板复制子代DNA;
  • 保护单链DNA,避免核酸酶的降解。
slide168
八、DNA拓扑异构酶
  • 能够松解DNA超螺旋结构的酶。

人类拓扑异构酶Ⅰ的分子结构

slide169

10

局部解链后

8

DNA复制过程中正超螺旋的形成

slide171

拓扑异构酶的作用特点

    • 既能水解 、又能连接磷酸二酯键
  • 分 类

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ

slide172

切断DNA双链中一股链,使DNA解链旋转不致打结;适当时候封闭切口,DNA变为松弛状态。切断DNA双链中一股链,使DNA解链旋转不致打结;适当时候封闭切口,DNA变为松弛状态。

反应不需ATP。

拓扑异构酶Ⅰ

切断DNA分子两股链,断端通过切口旋转使超螺旋松弛。

利用ATP供能,连接断端, DNA分子进入负超螺旋状态。

拓扑异构酶Ⅱ

DNA拓扑异构酶的作用机制

3 3 dna
3.3 DNA生物合成过程

3.3 The Process of DNA Biosynthesis

slide174
一、复制的起始
  • DNA复制的起始阶段,由下列两步构成。

1.解旋解链,形成复制叉:

    • 由拓扑异构酶和解链酶作用,使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开,碱基间氢键断裂,形成两条单链DNA。
    • 单链DNA结合蛋白(SSB)四聚体结合在两条单链DNA上,形成复制叉。
slide175
2.引发体组装和引物合成:
  • 由解螺旋酶(DnaB蛋白) 、DnaC蛋白、引物酶(DnaG蛋白)和DNA复制起始区域形成引发体;
  • 在引物酶的催化下,以DNA为模板,合成一段短的RNA片段,从而获得3'端自由羟基(3'-OH)。
slide176
二、复制的延长
  • 复制的延长指在DNA聚合酶催化下,以3’→5’方向的亲代DNA链为模板,从5’→3’方向聚合子代DNA链。其化学本质是dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上,磷酸二酯键不断生成。
  • 在原核生物中,参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ;而在真核生物中是DNA聚合酶δ。
slide177

3'

5'

DNA-pol

5'

DNA复制的延长过程

3'

OH 3'

dGTP

dTTP

dATP

dTTP

dCTP

dATP

dGTP

dCTP

slide179
三、复制的终止
  • 在复制过程中形成的RNA引物,需由RNA酶来水解去除;
  • RNA引物水解后遗留的缺口,由DNA聚合酶Ⅰ(原核生物)或DNA聚合酶(真核生物)催化延长缺口处的DNA,直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。

(一)去除引物,填补缺口:

slide180

(二)连接冈崎片段:

  • 在DNA连接酶的催化下,生成最后一个磷酸酯键,将冈崎片段连接起来,形成完整的DNA长链。
slide181

5

5

RNA酶

5

5

OH

P

DNA-pol Ⅰ

dNTP

5

5

P

ATP

DNA连接酶

ADP+Pi

5

5

随从链上不连续性片段的连接

4 4 dna
4.4 DNA的损伤(突变)与修复

4.4 DNA Damage (Mutation)and Repair

slide184

由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤,也称为突变(mutation)。由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤,也称为突变(mutation)。

  • 常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联,链的断裂,重组等。
slide185
一、突变的意义

(一)突变是进化、分化的分子基础

(二)突变导致基因型改变

(三)突变导致死亡

(四)突变是某些疾病的发病基础

slide186

二、引起突变的因素

(一)自发因素:

1.自发脱碱基:由于N-糖苷键的自发断裂,引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。

2.自发脱氨基:胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶,腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。

3.复制错配:由于复制时碱基配对错误引起的损伤,发生频率较低。

slide187

(二)物理因素:

  • 由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中,X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂,而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成,如TT,TC,CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构,因而会引起复制障碍。
slide189

(三)化学因素:

1.脱氨剂:如亚硝酸与亚硝酸盐,可加速C脱氨基生成U,A脱氨基生成H。

slide190
2.烷基化剂:这是一类带有活性烷基的化合物,可提供甲基或其他烷基,引起碱基或磷酸基的烷基化,甚至可引起邻近碱基的交联。2.烷基化剂:这是一类带有活性烷基的化合物,可提供甲基或其他烷基,引起碱基或磷酸基的烷基化,甚至可引起邻近碱基的交联。

3.DNA加合剂:如苯并芘,在体内代谢后生成四羟苯并芘,与嘌呤共价结合引起损伤。

4.碱基类似物:如5-FU,6-MP等,可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。

5.断链剂:如过氧化物,含巯基化合物等,可引起DNA链的断裂。

slide193

1. 转换

发生在同型碱基之间,即嘌呤代替另一嘌呤,或嘧啶代替另一嘧啶。

2. 颠换

发生在异型碱基之间,即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

  • DNA分子上单一碱基的改变称点突变(point mutation)。
slide194

肽链

N-val·his·leu·thr·pro ·glu·glu ······C

CTC GAG

基因

肽链

N-val·his·leu·thr·pro ·val·glu ······C

CAC GTG

基因

血红蛋白-亚基的点突变

正常成人Hb (HbA)亚基

镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基

slide195

3. 缺失:一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。

4. 插入:原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。

  • 缺失或插入都可导致框移突变。
  • 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变,造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。
slide196

正常

5’ ……G C AG U AC A UG U C ……

丙 缬 组 缬

缺失C

5’ ……G A GU A CA U GU C ……

谷 酪 蛋 丝

缺失引起的框移突变

slide197

5.重排 DNA分子内较大片段的交换,称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型

slide198

无差错修复

有差错倾向修复

四、DNA损伤的修复

  • DNA损伤修复(repair) :是对已发生分子改变的补偿措施,使其尽可能回复为原有的天然状态。

修复的主要类型:

  • 光修复(light repair)
  • 切除修复(excision repair)
  • 重组修复(recombination repair)
  • SOS修复
slide199

(一)光修复(light repair):

  • 这是一种广泛存在的修复作用,能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。
  • 修复过程由光修复酶(photolyase)催化完成。

光修复酶的

分子结构

slide200
其修复过程为:
    • 光修复酶(photolyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物。
    • 在300~600nm可见光照射下,酶获得能量,将嘧啶二聚体的丁酰环打开。
    • 光修复酶从DNA上解离。
slide201

(二)切除修复(excision repair):

  • 这也是一种广泛存在的修复机制,可适用于多种DNA损伤的修复。
  • 切除修复机制的基本过程是将受损的DNA片段切除,然后再以对侧链为模板,重新合成新链进行修复。
slide202
在原核生物中,与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC,以及DNA pol Ⅰ和DNA连接酶。
  • UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用;而UvrC则主要与受损片段的切除有关。
slide204
真核生物XP切除修复系统

1.识别

4.修复

2.组装

3.切除

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(三)重组修复(recombination repair):

  • 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。
  • 修复时,利用重组蛋白RecA的核酸酶活性,将另一股健康亲链与损伤缺口相互交换。

RecA的分子结构

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(四)SOS修复(SOS Repair):

  • 当DNA损伤广泛难以继续复制时,由此而诱发出一系列复杂的反应。
  • 在E. coli中,各种与修复有关的基因,组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。
  • 这种修复特异性低,对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复,复制如能继续,细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多,导致较广泛、长期的突变。
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第五节 RNA的生物合成 (转录)

Section 5 RNA Biosynthesis, Transcription

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RNA

DNA

转录

  • 在RNA聚合酶的催化下,以一段DNA链为模板合成RNA,从而将DNA所携带的遗传信息传递给RNA的过程称为转录(transcription)。
  • 经转录生成的RNA有多种,主要的是rRNA,tRNA,mRNA,snRNA和HnRNA等。
5 1 rna
5.1 RNA转录合成的特点

5.1 Characters of RNA Biosynthesis

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一、转录的不对称性

  • 转录(transcription)的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录,从而将遗传信息由DNA传递给RNA。
  • 对于不同的基因来说,其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。
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模板链

5’

5’

3’

3’

5’

5’

编码链

  • 能够转录RNA的那条DNA链称为模板链(template strand) ,也称作有意义链或Watson链。
  • 与模板链互补的另一条DNA链称为编码链(coding strand),也称为反义链或Crick链。
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转录方向

5

3

3

5

转录方向

模板链和编码链的相对性

编码链

模板链

模板链

编码链

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编码链

5′···GCAGTACATGTC ···3′

3′··· c g t g a t g t a c a g ···5′

模板链

转录

mRNA

5′···GCAGUACAUGUC ···3′

翻译

N······Ala · Val · His · Val ······C

蛋白质

模板链、编码链与转录及翻译的关系

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二、转录的连续性

  • RNA转录合成时,以DNA作为模板,在RNA聚合酶的催化下,连续合成一段RNA链,各条RNA链之间无需再进行连接。
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三、转录的单向性

  • RNA转录合成时,只能向一个方向进行聚合,所依赖的模板DNA链的方向为3'→5',而RNA链的合成方向为5'→3'。
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四、有特定的起始和终止位点

  • RNA转录合成时,只能以DNA分子中的某一段作为模板,故存在特定的起始位点和特定的终止位点。
  • 特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位,通常由转录区和有关的调节顺序构成。
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5.2 参与转录合成的酶和蛋白因子

5.2 Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis

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参与RNA转录合成的物质

  • 原料:NTP (ATP, UTP, GTP, CTP)。
  • 模板:单链DNA。
  • 酶:RNA聚合酶(DDRP,RNA-pol)。
  • 其他蛋白质因子:如转录因子、终止因子等。
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一、RNA聚合酶(DDRP)

  • 这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶(DDRP)。
  • 该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下,不需要引物,即可从5'→3'聚合RNA。
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(一)原核生物的RNA聚合酶

  • 原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成,即2'。
  • 亚基与转录起始点的识别有关,在转录合成开始后被释放;余下的部分(2')被称为核心酶,与RNA链的聚合有关。
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



原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶

核心酶 (core enzyme)

全酶 (holoenzyme)

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(二)真核生物的RNA聚合酶

  • 真核生物中的RNA聚合酶可按其对-鹅膏蕈碱的敏感性而分为三种,它们均由10~12个大小不同的亚基所组成,结构非常复杂,其功能也不同。
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二、转录因子

  • 在真核生物中,转录的起始过程较为复杂,现已发现数百种蛋白因子与RNA转录合成有关。
  • 直接或间接参与转录起始复合体的形成的蛋白因子被称为转录因子(transcriptional factor, TF)。
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三、终止因子

  • 原核生物中的终止因子蛋白是一种六聚体的蛋白质,亚基的分子量为50kd。
  • 蛋白能识别转录终止信号,并与RNA紧密结合,导致RNA的释放。
5 3 rna
5.3 RNA转录合成的过程

5.3 The Process of RNA Biosynthesis

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原核生物转录过程

(一)转录起始

  • 转录起始需解决两个问题:
  • RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。
  • DNA双链解开,使其中的一条链作为转录的模板。
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调控序列

结构基因

53

35

RNA-pol

1. 模板与酶的辨认识别:

  • 在原核生物中,若干功能相关的结构基因常常串联在一起,由其上游的同一调控序列进行调控,这种基因的组织形式称为操纵子(operon)。
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原核生物转录起始时,首先由RNA聚合酶中的因子识别转录起始点,并促使核心酶结合形成全酶复合物。原核生物转录起始时,首先由RNA聚合酶中的因子识别转录起始点,并促使核心酶结合形成全酶复合物。
  • 位于基因上游,与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA调控序列被称为启动子(promoter)。
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RNA聚合酶保守区

结构基因

3

5

5 

3 

3 

5 

3

5

-50

-40

-30

-20

-10

1

10

开始转录

-35 区

-10 区

T T G A C A

A A C T G T

T A T A A T Pu A T A T T A Py

RNA-pol辨认位点

(recognition site)

(Pribnow box)

原核生物启动子的保守序列

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被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。被RNA聚合酶辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。
  • RNA聚合酶与该区结合后,即滑动至-10区的TATAAT序列(Pribnow盒),并启动转录。
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2. 转录的起始过程:

⑴ RNA聚合酶全酶(2)与模板结合。

⑵ DNA局部双链解开。

⑶ 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应,形成转录起始复合物。

5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN- OH 3 + ppi

转录起始复合物:

RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3

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(二)转录延长

  • 因子从全酶上脱离,余下的核心酶继续沿DNA链移动,按照碱基互补原则,不断聚合RNA。

1. 亚基脱落,RNA–pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛,沿着DNA模板前移;

2. 在核心酶作用下,NTP不断聚合,RNA链不断延长。

(NMP) n +NTP(NMP) n+1 + PPi

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(三)转录终止

  • RNA转录合成的终止机制有两种:

1.依赖Rho因子的转录终止:

    • 由终止因子(因子)识别特异的终止信号,并促使RNA的释放。
slide243

2.非依赖Rho的转录终止:

  • 模板DNA链在接近转录终止点处存在相连的富含GC和AT的区域,使RNA转录产物形成寡聚U及发夹形的二级结构,引起RNA聚合酶变构及移动停止,导致RNA转录的终止。
slide244

UUUUU...…

UUUU...…

茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构

DNA

5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT... 3

5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU... 3`

RNA

slide245

茎环结构使转录终止的机理

  • 使RNA聚合酶变构,转录停顿;
  • 使转录复合物趋于解离,RNA产物释放。
slide246
5.4 转录后修饰

5.4 Post-transcriptional Modification

slide247

一、真核生物mRNA的转录后加工

1.加帽(adding cap):

  • 即在mRNA的5'-端加上m7GTP的结构。此过程发生在细胞核内,即HnRNA即可进行加帽。
  • 加工过程首先是在磷酸酶的作用下,将5'-端的磷酸基水解,然后再加上鸟苷三磷酸,形成GpppN的结构,再对G进行甲基化。

(一)首、尾的修饰

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磷酸酶

5 pppGp…

5 ppGp…

Pi

pppG

鸟苷酸转移酶

ppi

5 GpppGp…

SAM

甲基转移酶

5m7GpppGp…

帽子结构的生成

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2.加尾(adding tail):
  • 这一过程也是细胞核内完成,首先由核酸外切酶切去3'-端一些过剩的核苷酸,然后再加入polyA。
  • polyA结构与mRNA的半寿期有关。
slide250
(二)mRNA的剪接(splicing)

mRNA

DNA

鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图

slide251

A

B

C

D

非编码区

1. 断裂基因(splite gene)

  • 真核生物结构基因,由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成,去除非编码区再连接后,可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质,这些基因称为断裂基因。

编码区 A、B、C、D

slide252

外显子(exon)和内含子(intron)

  • 外显子——在断裂基因及其初级转录产物上出现,并表达为成熟RNA的核酸序列(结构基因中能够指导多肽链合成的编码顺序)。
  • 内含子——隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列(不能指导多肽链合成的非编码顺序)。
slide253

2. hnRNA和snRNA:

  • 核内带有外显子和内含子编码序列的初级RNA转录产物称为杂化核RNA(hetero-nuclear RNA, hnRNA)。
  • hnRNA经剪接加工除去内含子编码序列并将外显子编码序列连接起来才能形成成熟的mRNA。
slide254
snRNA为核内小RNA,富含尿嘧啶,故以U作分类和命名,如U1、U2等。snRNA与核内蛋白质组装形成小核蛋白体(snRNP),参与hnRNA的剪接加工。snRNA为核内小RNA,富含尿嘧啶,故以U作分类和命名,如U1、U2等。snRNA与核内蛋白质组装形成小核蛋白体(snRNP),参与hnRNA的剪接加工。
slide255

鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰

鸡卵清蛋

白基因

hnRNA

首、尾修饰

hnRNA剪接

成熟的mRNA

slide256
二、tRNA的转录后加工
  • 主要有以下几种加工方式:
    • 切断。
    • 剪接。
    • 3’-末端-CCA序列添加。
    • 化学修饰。
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DNA

TGGCNNAGTGC

GGTTCGANNCC

tRNA前体的转录合成

RNA pol Ⅲ

tRNA前体

slide260

(1)甲基化

如:A  Am

(1)

(2)

(2)还原反应

(1)

如:U  DHU

(3)核苷内的转位反应

如:U  ψ

(4)脱氨反应

(3)

如:A  I

(4)

tRNA的碱基修饰

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