טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני : החזון והמציאות

1. טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של שיבוט וריפוי גני:החזון והמציאות

2. תאי גזע עובריים בתרבית • המאפיינים העיקריים של תאי גזע עובריים: • התחדשות עצמית בלתי מוגבלת • פלוריפוטנטיות עכבר – 1981 אדם – 1998

3. תנאים בסיסים למחקר בתאי גזע עובריים שליטה על גדילת התאים במצב בלתי ממוין בתרבית יכולת השריית התמיינות ספציפית על התאים תאי גזע עובריים

4. גידול בתרבית - גופיפים עובריים הזרקה לעכברים -טרטומות התמיינות תאי גזע עובריים אנדודרם התמיינות סטוכסטית מזודרם תאי גזע עובריים לא ממוינים אקטודרם

5. הוספת פקטורים ספציפים לתרבית הנדסה גנטית התמיינות תאי גזע עובריים אנדודרם התמיינות מושרה אקטודרם תאי גזע עובריים לא ממוינים

6. תכנות מחדש (reprogramming) של תאים סומאטיים “The reversal of the differentiation state of a mature cell to one that is characteristic of the undifferentiated embryonic state” Gurdon, 1962

7. שיבוט למטרת ריפוי Therapeutic Cloning Cloning Gene & cell therapy ES cells isolation

8. שיבוט למטרות ריפוי לעומת שיבוט למטרות רבייה שיבוט בלסטוציסט הפריית מבחנה בידוד תאי המסה הפנימית גידול בתנאים מתאימים ליצירת תאי גזע עובריים לא באדם!

9. cloning First somatic cloning in mammals כבשה 1996 Lamb 6LL3 - Dolly Wilmut I. et al, Nature, 1997

10. מינים משובטים חולדה 2003 פרד 2003 סוס 2003 כלב 2005 עכבר 1996 פרה 1998 עז 1999 חזיר 2000 חתול 2002 ארנב 2002 zebra-fish 2002

11. שיבוט בבני אדם Science. 2004 Mar 12;303(5664):1669 Science. 2005 Jun 17;308(5729):1777

12. מאמר הבית William M. Rideout, III 6, , 1, Konrad Hochedlinger 6, , 1, , 2, Michael Kyba 6, , 1, George Q. Daley 1, 3 and Rudolf Jaenisch , , 1, 4

13. עכברי Rag2 -/- • ללא האנזים, recombinaseRAG2, לא מתבצע ה-VDJ rearrangement. • עכברי RAG2 -/- הם עכברי SCID, ללא תאי T תאי B. • בתנאים סטריליים העכברים חיים בצורה נורמאלית • ניתן לתקן את מערכת החיסון של העכברים ע"י הזרקת תאי גזע המטופואטים מעכברי WT

14. Proof of principle for therapeutic cloning combined with gene therapy

15. Tetraploid embryo complementation two cell embryos (diploid) one cell embryos (teraploid) electrofusion injection of ES cells teraploidblastocysts Eakin GS et al. Dev Dyn. 2003; 228: 751

16. ההוכחה שתאי ntES הם אכן פלוריפוטנטים Tetraploid embryo complementation • העובר נוצר מתאי ה-ES והתאים הטטרפלואידים תורמים ליצירת השלייה. הצליחו לקבל 4 עכברונים חיים 28% (4/14)

17. תיקון המוטציה ב-RAG2 ע"י רקומבינציה הומולוגית האלל המוטנטי, מכיל מחדר בתוך אקסון 3 הקונסטרוקט לצורך תיקון המוטציה LoxP LoxP תוצר הרקומבינציה ההומולוגית האלל המתוקן לאחר הוצאת סמן הסלקציה Rag2+R/-

18. האלל המתוקן (Rag2 +R/-) יוצר מערכת חיסון תקינה • Tetraploid embryo complementation • הזרקת תאי ntES Rag2+R/- • אנליזת PCR לזיהוי rearrangements בתאי B ותאי T • אנליזת FACS עם נוגדנים כנגד תאי B ותאי T

19. האלל המתוקן (Rag2 +R/-) יוצר מערכת חיסון תקינה בעכברי Rag2-/- -תיקון in-vivo • שימוש בעכברי Rag2+R/-כתורמים של HSC (Hematopoietic stem cells) לעכברי Rag2-/- • אנליזת FACS עם נוגדנים כנגד תאי B ותאי T ntES cells "מתוקנים" מעכברי Rag2 -/- יכולים ליצור תאי מח עצם נורמאלים.

20. Rag2 -/- hematopoietic stem cells WT השריית התמיינות in vitro על תאי ntES והשתלתם בעכברי Rag2 -/- EBs Repaired ntES 6 ימים 14 ימים Hematopoietic cytokines HOXB4 GFP

21. מדוע התאים נדחו בעכברי Rag2 -/- ? • העמידות כנגד ההשתלה היא תכונה ספציפית של עכברי ה Rag2-/- • התאים מבטאים רמה נמוכה של MHC • תאי NK הורגים תאים המבטאים רמה נמוכה של MHC • יתכן שעכברי Rag2-/-מבטאים רמה גבוהה של NK cells

22. האם הדחייה נובעת מתגובה של תאי NK? • השתלת התאים לעכברים ללא תאי NK Rag2-/- ,gC null Rag2 +/- ES hematopoietic stem cells

23. תוצאות ההשתלה בעכברי Rag2 -/- ,γC null • התאים לא נדחו • 95% מהתאים בדם הפריפרי ביטאו GFP • בעיקר תאים מילואידים (גרנולוציטים) וכמות קטנה מאד של תאי B ותאי T תאי B גרנולוציטים תאי B תאי T

24. סיכום • VDJ recombination restored • Low level of T/B cells in blood. • High level of granulocytes. NK-/-

25. סיכום ומסקנות • מטרת העבודה – תיקון פגמים גנטים בעכבר ע"י שילוב של "therapeutic cloning" ו gene therapy • פעילות האנזים Rag2 משוחזרת בתאי ntES מוטנטים שתוקנו ע"י רקומבינציה הומולוגית • התקבל שחזור מסויים של מערכת החיסון בעכברי ה- SCID • שתי בעיות עיקריות: • דחייה ע"י NK cells • התמיינות לימפואידית נמוכה ביותר • יתכן שזה נובע מביטוי של HoxB4ש"דוחף" לכיוון התמיינות מילואידית פרוטוקולים משופרים של התמיינות יפתרו כנראה את הבעיה.

26. אסטרטגיות שונות "לתכנת מחדש" תאים Jaenisch R & Young R., Cell 2008

27. תכנות מחדש ע"י הדבקה רטרו-ויראלית של פקטורים ידועים (iPS-induced pluripotent stem cells) Jaenisch R & Young R., Cell 2008

28. Morphological Changes Following Infection with the 4 Factors Morphological changes (Day 7) mIPS colonies at Day>20 WT-MEFs Mouse iPS- First reported 2006 Human iPS- First reported December 2007 Fibroblasts Human iPS

29. טיפול במחלות גנטיות על ידי שילוב של “"תכנות מחדש" (iPS) וריפוי גני:החזון והמציאות

30. Treating Sickle-Cell Anemia with iPS Cells The future? L.C Hanna J et al., Science 2007

31. שבוע הבא- הרצאה של יעקוב ביום שני|(29.12.08) בשעה שתיים בחדר סמינרים- מומלץ!