ProteinLab מעבדה ממוחשבת לניקוי חלבונים

1. ProteinLab מעבדה ממוחשבת לניקוי חלבונים

2. ProteinLab - הקדמה • תוכנה זו נכתבה באוניברסיטת לידסניתנת להורדה כאן, וניתן בעזרתה לתרגל ניקוי חלבונים • התוכנה מכילה קובץ נתונים המדמה תערובת של 20 חלבונים (מזוהים במספרים סידוריים) • עבור כל חלבון ידועים מס' נתונים בסיסיים. עליכם לבחור את שיטות הניקוי היעילות ביותר כך שהחלבון ינוקה בצורה אופטימלית • אזהרה: אי יעילות עלולה לשמש עילה לפיטוריכם! 

3. ProteinLab – ההתחלה... • לאחר הקלקה כפולה על אייקון התוכנה , יופיע מסך הפתיחה. • Begin Start from Beginning • לאחר מכן יופיע החלון הבא: בוחרים: לא • החלבון שעליכם לנקות (מתוך 20 החלבונים שבמאגר) הוא סכום שתי ספרות הביקורת בתעודות הזהות של שני בני הזוג. הקישו את מספרו. • לאחר שבחרתם, תופיע תיבת טקסט ובה מס' נתונים בסיסיים על החלבון. יש להעתיק נתונים אלו למחברתכם מאחר שהם לא יופיעו יותר! • עליכם להיעזר בנתונים התחלתיים אלו לצורך ניקוי החלבון

4. (הקליקו על השורות המוארות כדי לקבל מסך לדוגמה)

5. ProteinLab – פירוט שיטות ההפרדה Ammonium Sulphate • שיטה המבוססת על עיקרון salting out : ריכוז מלח עולה מסיסות חלבון יורדת • יש לבחור את אחוז ההשקעה ולאשר. התוכנה תחשב את פעילות האנזים וכמות החלבון במשקע ובנוזל העליון שהתקבל • על פי התוצאות, יש לבחור האם רוצים להמשיך את הניקוי עם הנוזל העליון או עם המשקע • כדאי לנסות הפרדות באחוזי Amm. Sulphateשונים עד למציאת התנאים הטובים ביותר להפרדה

6. Heat denaturation • יש לבחור את הטמפרטורה ואת משך הזמן שבו החלבונים יעברו דנטורציה • יש לשמור על תנאים בהם תשמר פעילות האנזים לפי האינפורמציה ההתחלתית שקבלת על האנזים

7. Gel filtartion • הפרדה המבוססת על הבדלים בגודל תת היחידות של החלבון • ככל החלבון קטן יותר, הוא יתעכב יותר בקולונה ויצא בפרקציות המאוחרות יותר. • לקולונות שונות יש יכולות רזולוציה שונות (לחיצה על “info”תיתן את הרזולוציות עבור הקולונות השונות)

8. Gel filtartionהמשך • לאחר בחירת הקולונה הרצויה, תקבל גרף של הפרקציות שהתקבלו כתוצאה מההפרדה בקולונה

9. בדיקה ואיסוף הפרקציות האפשרויות המופיעות בתפריט Fraction: • Assay enzyme activity– מראה מי מבין כל הפרקציות מכילה את החלבון הרצוי • Dilute fractions – במידה ולא רואים את הקצה של אחד הפיקים, יש להשתמש באפשרות זו כדי למהול את המקטעים (לזכור שמהילת יתר עלולה לפגוע בפעילות האנזים המבוקש) • Pool fractions – איסוף הפרקציות: יש לסמן בעזרת העכבר את גבולות הפרקציה שרוצים לאסוף חשוב: אחרי שמסמנים לא ניתן לבטל את הפעולה, אלא חייבים להתחיל הכל מההתחלה !

10. Ion exchange chromatography שיטת הפרדה המבוססת על מטען החשמלי של המולקולות • ניתן להשתמש ב 4 קולונות: • קולונות הספרוז טעונות בטווח רחב יותר של PHמקולונות הצלולוז • לאחר שבחרתם קולונה, יש לבחור את ה PHשל בופר שיווי המשקל. • לאחר מכן מתכננים את הריכוז העולה של גרדיאנט המלח. (שטיפה- ריכוז נמוך, אילוציה- ריכוז גבוה) • מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלו. בדוק פעילות אנזים בפרקציות ואסוף את הפרקציה הפעילה ביותר.

11. Hydrophobic interaction chromatography • ניתן לבחור בין 2 קולונות: • Phenyl Seph - משמשת להפרדת חלבונים מאוד הידרופוביים • Octyl Seph - משמשת להפרדת חלבונים פחות הידרופוביים • לאחר שבחרתם קולונה, עליכם לבחור את טווח גרדיאנט המלח להפרדה • ריכוז התחלתי גבוה אשר מגביר את קשירת החלבון לקולונה • האילוציה מתבצעת בריכוז מלח נמוך אשר מגביר את מסיסות החלבון והתנתקותו מהקולונה • גם כאן מתקבל גרף המתאר את הפרקציות שהתקבלו; יש לאסוף את הפרקציה הפעילה ביותר

12. Isoelectric focusing • יש לבחור את טווח ה PH להפרדה (אין נתונים מראש) • לאחר שמתקבל גרף ההפרדה, יש לאסוף את הפרקציה הטובה ביותר Affinity Chromatography • מפריד את האנזים המבוקש על בסיס אינטראקציה ספציפית של אנזים סובסטרט או רצפטור-ליגנד. • אפשרות זו זמינה רק בחלק קטן מהחלבונים

13. ולא לשכוח... • לכל פעולה יש מחיר, והתוכנה נותנת הערכה שלו. • ה- cost מבטא שני מרכיבים עיקריים- עלות הריאגנטים והציוד, ומשך הזמן שהפעולה לוקחת. • מובן שעדיף קודם לנצל את הפעולות שעלותן נמוכה (דנטורציה בחום, השקעה באמוניום סולפט) מאשר להתחיל באלו שעלותן גבוהה. • ככלל, 2-3 פעולות זולות יעלות לרוב מפעולה אחת יקרה.

14. ProteinLab – הסוף... • תרגיל להגשה (עבודה בזוגות): • סכמו בקצרה את שיטות ההפרדה הנזכרות בתוכנה • כל זוג יקבל חלבון להפרדה. עליכם להעשיר את החלבון פי 15 לפחות תוך שימוש ב-4 או יותר שיטות הפרדה • יש להגיש את דו"ח ההתקדמות שהתוכנה יצרה מלווה בדיון תמציתי (אילו פעולות היו יעילות, ואילו היו מיותרות). • בצעו את ההוראות הנ"ל ביחס לחלבון הנוסף שקיבלתם. • השוו בין שני החלבונים שלכם, והסיקו מסקנות ביחס אליהם (PI, משקל מולקולרי, טמפרטורה, יציבות ל-pH, הידרופוביות). • המצגת זמינה באתר הקורס.

15. ועוד כמה מילים טכניות • בכל שלב ניתן לראות את דו"ח הפעילות שלכם על ידי הקשה על : Help progress report • כל עוד לא סיימתם את פעולת הניקוי הנוכחית תוכלו לבטלה על ידי: Quit Abandon this step and continue • כדי לצאת מהתוכנה ולהתחיל מהתחלה: Quit Abandon scheme and start again

16. חשוב ביותר !!!! בכל שלב כתבו במחברתכם את נתוני הפעולה שביצעתם. התוכנה אינה שומרת את הנתונים הללו, אלא רק את התוצאות שהתקבלו מהם. • את הדו"ח שהתוכנה נותנת "צלמו" בעזרת מקש “print screen”שבמקלדת, והדבקתו בתוכנת paintשב- PC, משם תוכלו לגזור את החלקים הרלוונטיים.

17. THE END

20. Progress Report

21. 2-Dimensional PAGE על מנת לזהות את האנזים המבוקש : Stain Immunoblot