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―RT 系统

“ 从 RNA 提取到荧光定量 PCR” 解决方案. ―RT 系统. TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD. RT- PCR 原理简介 RT-PCR 技术中的关键点 TIANGEN 公司 RT 产品选择指南. RNA. cDNA. RT. PCR. 目的 片段. RT-PCR 原理简介. cDNA 第一链合成法示意图（两步法）. 一步法实验示意图（同一个反应管中 ）. Two Step RT-PCR. cDNA 分装. One Step RT-PCR. RT-PCR 两种方法. 适用于 mRNA 表达量解析

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Presentation Transcript

  1. “从RNA提取到荧光定量PCR”解决方案 ―RT系统 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD

  2. RT-PCR原理简介 • RT-PCR技术中的关键点 • TIANGEN公司RT产品选择指南

  3. RNA cDNA RT PCR 目的 片段 RT-PCR原理简介

  4. cDNA第一链合成法示意图（两步法）

  5. 一步法实验示意图（同一个反应管中）

  6. Two Step RT-PCR cDNA分装 One Step RT-PCR RT-PCR两种方法 • 适用于mRNA表达量解析 • Two Step RT-PCR效率高 • 使用Random和Oligo-dT • 引物可以制备cDNA pool • cDNA可长期保存 • 适用于病毒、病原菌检测 • 操作简单 • 污染几率低

  7. Random 6mer 5’ 3’ 目的片段 F R 1,500base 2,000base Oligo dT Primer 5’ 3’ AAA···A 目的片段 F R Gene specific Primer 5’ 3’ 目的片段 F R RT引物的选择 目的片段在mRNA任何位置都能使用。通常mRNA表达量分析最适。 目的片段在距Poly(A) Tail 2kbp以内适用。 One Step RT-PCR只能使用Gene specific Primer， 不适用于mRNA表达量分析等复数基因的检出。

  8. RT-PCR原理简介 • RT-PCR技术中的关键点 • TIANGEN公司RT产品选择指南

  9. RT反应体系 • 模板：总RNA，mRNA，体外转录的RNA • 引物：随机引物，Oligo dT，基因特异性引物(GSP) • 反转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase

  10. 逆转录酶的选择 • AMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42℃。 • MMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最 适37℃或42℃。 • Quant Reverse Transcriptase 全新高效逆转录酶，与RNA模板的亲和力强， 对GC含量高的模板通 读效果好，质量稳定，最适37℃。

  11. RNase H的作用 • 水解RNA-DNA杂合链中的RNA

  12. RT实验要素－决定反应的特异性及灵敏性 • 分离高质量RNA • 使用高活性的逆转录酶 • 提高逆转录酶保温温度 • 减少基因组DNA污染

  13. 问题1：RT-PCR没有产物 原因 • 分离无污染、高质量的RNA，用0.1－0.5μg乙酰BSA增加RNA的量 • 用70%乙醇洗涤RNA • 确定退火温度适合实验中所用的引物 • PCR步骤中cDNA模板不能超过反应体积的1/5 • 尝试其它组织 • RNA降解或起始量少 • RNA提取后含抑制成分 • cDNA合成时引物退火 • 不充分 • PCR失败 • 目的基因在组织中不 • 表达或表达量低 对 策

  14. 问题2：非特异性扩增

  15. 原因 • 用扩增级DNase1处理RNA,使用抗气雾剂的吸头 • cDNA合成中使用基因特异性引物，使用递减PCR • 遵循用于扩增引物设计的同样原则 • 设计在3’端没有互补序列的引物 • 优化镁离子浓度 • RNA中有内源或外源DNA污染 • 引物和模板非特异性退火 • 基因特异性引物设计较差 • 形成引物二聚体 • 镁离子浓度太高 对 策 非特异性扩增

  16. 问题3：弥散

  17. 弥 散 原因 • 常规PCR步骤中减少模板cDNA的量 • 提取高质量RNA，防止被DNA污染 • 减少引物的用量 • 优化PCR反应条件，减少PCR的循环次数 • 提高退火温度，防止非特异性的起始及延伸 • cDNA第一链产物的含量过高 • DNase降解DNA产生的寡核苷酸的非特异性扩增 • PCR反应中引物过多 • 循环数过多 • 退火温度过低 对 策

  18. RT-PCR原理简介 • RT-PCR技术中的关键点 • TIANGEN公司RT产品选择指南

  19. TIANGEN公司RT产品系列

  20. 谢谢！ 谢谢！

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