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李 萍. 关于微生物系统代谢工程为氨基酸生产. 主要内容. 摘要. 前言. 经典模式转向系统代谢工程. 系统代谢工程工具. 应用系统代谢工程进行氨基 酸生产. 结论. 摘 要.
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李 萍 关于微生物系统代谢工程为氨基酸生产
主要内容 • 摘要 • 前言 • 经典模式转向系统代谢工程 • 系统代谢工程工具 • 应用系统代谢工程进行氨基 酸生产 • 结论
摘 要 传统上是采用随机突变和筛选的方法提高微生 物生产氨基酸的效率，这样可能使细胞代谢引起 意想不到的生理上的改变。合理的基因组范围内 的代谢工程是以系统和合成生物学的方法为基础 的，被称为系统代谢工程，它被上升为解决这些 问题的方法。目前，一些氨基酸生产商利用系统 代谢工程已经成功的得到了发展，这里的这些代谢工程步骤在系统生物框架中实行，并且整个代谢网路，包括复杂的调控回路，被设计为一个整体的方法。在本文中作者评论了系统代谢工程成功应用于开发氨基酸生产菌株的当前状况和讨论了未来的希望。
前 言 • 目前年生产氨基酸的产量超过二百万吨。但氨基酸的应用非常广泛，像食品添加剂、医药品、动物饲料添加剂、化妆品和聚合体原料等等。目前一些氨基酸被用作生产生物燃料和抗生素的重要的中间前体。由于氨基酸市场增长迅速而同时竞争越来越大，研究员开始将他们的努力放在提高氨基酸生产效率以达到最高可能的水平。 • 传统上，多发随机突变和筛选已经应用在开发氨基酸生产菌株上。但是这个方法经常引起基因组多余的改变，而且这些结果不容易被识别。由于这些未知的特征存在于随机突变中，通过合理的代谢工程的方法进一步提高细胞内活动变得非常困难。
前 言 • 系统代谢工程是一个理想的开发生产氨基酸和其它产物菌株的方法。在系统代谢工程中，工程目标是通过考虑整个代谢和调控网络以及中游（发酵）和下游（回收和净化）过程来决定的。在实际的代谢工程中，改变这些目标对整个代谢的影响检测到反馈信息。开发代谢工程的反复运作模式是通过以菌株开发为基础的，最终能够获得理想的代谢显型。在这篇文章中，我们简要的介绍了系统代谢工程的工具，概括了最近的一些文献应用系统代谢工程的方法生产氨基酸和提出了未来的前景。
1991年，著名生化工程专家，美国加州理工学院化学系教授Bailey将代谢工程定义为：应用DNA重组技术优化细胞的酶活、运输及调节功能来提高细胞活力，亦即利用DNA重组技术对细胞的酶促反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞活性的过程。1991年，著名生化工程专家，美国加州理工学院化学系教授Bailey将代谢工程定义为：应用DNA重组技术优化细胞的酶活、运输及调节功能来提高细胞活力，亦即利用DNA重组技术对细胞的酶促反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞活性的过程。 代谢工程（systems metabolic enginerring )
经典模式转向系统工程 开发氨基酸生产策略现在正从随机变异发生过渡到系统代谢工程。在这部分描述了一些策略的代表性的例子。 • 粘质沙雷菌 — 抗氧肟酸盐L-异亮氨酸突变菌株 ， • 它是野生菌株在NTG处理后分离得 • 到的，能产12mg/ml L-异亮氨酸 • 谷氨酸棒状杆菌— 抗氨二基半胱氨酸菌株，它是野 • 生菌株在NTG处理后分离得到的， • L-异亮氨酸的产量达到44 mg/ml
经典模式转向系统工程 采用系统代谢工程的一些例子 • 生产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株，Radmacher 等敲除了ilvA 和panBC基因且过量表达ilvBNCD基因。最终改造的菌株能够产生10.6g/L的L-缬氨酸。通过去除乙酰羟酸L-缬氨酸合成酶反馈抑制进一步改善这个菌株，导致L-缬氨酸的产量增加43%。 • 谷氨酸棒状杆菌丙酮酸脱氢酶缺陷性菌株过表达基 因ilvBNCE被发现通过分批补料发酵产生24.6g/L的L-缬氨酸。为了L-缬氨酸的生物合成，通过删除pqo和pgi基因分别以达到增加丙酮酸和NADPH实用性来进一步改善菌株。结果谷氨酸棒状杆菌过量表达ilvBNCE基因能够通过分批补料发酵产生48.0g/L的L-缬氨酸。
经典模式转向系统工程 • 一个L-丝氨酸高产菌株谷氨酸棒状杆菌也通过目标代谢工程构建成功。L-丝氨酸脱氢酶去除的菌株过表达抗反馈抑制的3-磷酸脱氢酶，磷酸丝氨酸转氨酶和磷酸丝氨酸磷酸酶能产生8.2g/L L-丝氨酸。通过减少叶酸供应量来进一步改进谷氨酸棒状杆菌过表达serACB基因能够产生32.8g/L的L-丝氨酸。
系统代谢工程工具 • 基因组学 —对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析。 • 转录组学 —是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简而言之，转录组学是从RNA水平研究基因表达的情况。一个重要方法就是利用DNA芯片技术检测有机体基因组中基因的表达。
系统代谢工程工具 • 代谢组学 —代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的重要组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。代谢物指纹分析和液相色谱-质谱联用是代谢组学研究的最常用的两种方法。
系统代谢工程工具 • 蛋白质组学 —它旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定性检测、细胞内定位、相互作用研究等，最总揭示蛋白质的功能，是基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁。 • Fluxome — 是全部量化通量数额的所有细胞中的代谢产物。在分析流量平衡波动和蛋白质代谢的关键要素。该组学概念fluxome是有用的量化所有的代谢产物的调控网络。
应用系统代谢工程进行氨基酸生产 • 通过基因组工程结合转录组学分析和基因敲除在硅片上模仿大规模的基因组代谢网络构建了一个有效生产L-缬氨酸的大肠杆菌。不利于L-赖氨酸生产的 像反馈抑制、转录衰减调控的基因被位点特异性基因组工程去除， L-赖氨酸生物合成的竞争路径相关基因去除，ilvBN操纵子被扩增。产量达到0.066g L-赖氨酸 /1g葡萄糖。通过使livJ失活阻止摄入L-缬氨酸以lrp过表达提高L-缬氨酸的产量，livJ负责摄取L-缬氨酸和通过激活ikvIH编码乙醛酸合成酶来提高L-缬氨酸的生物合成。同样通过它与Lrp的协同效应，最近鉴定的L-缬氨酸输出者（ygaZH）大大地减少提高L-缬氨酸产量的难度。为了更进一步的改进，三个基因敲除的变异菌株（DaceF Dmdh DpfkA），预测基因敲除模仿硅片上大规模的基因代谢模型被构建成功了。这个菌株能够使L-缬氨酸的产量达到每克葡萄糖产0.378克L-缬氨酸。
结 论 • 氨基酸合成路径非常复杂且严格规范。所以微生物不能正常的生产理想水平的氨基酸。传统的方法是采用随机变异和筛选的方法开发氨基酸生产菌株，而现在补充有合理的代谢工程，它成为了生物组学中更加有用的工具已经可以使用了。并且以综合的分析生物组学数据和大规模基因组代谢模型为基础的系统代谢工程允许开发具有清晰基因型的优良菌株。这个方法将来会广泛的应用作为我们理解细胞是一个不断进步的系统。
结 论 尽管在生物信息学和系统生物学去识别复杂的生物组学数据方面取得了巨大的进步 ，但是为了他们完整的分析需要开发新的方法。为了使运算法则在硅片上大规模的代谢和调控网模仿更精确和实际，需要开发最优化菌株设计策略。另外，与代谢工程策略相结合的方法考虑到发酵和回收过程在菌株开发的早期将会很有益。当这些完成了以后，系统代谢工程将成为菌株开发更强有力的策略。
