第八章 园艺产品采后 生物技术

1. 第八章 园艺产品采后 生物技术

2. 第一节 生物技术的基本概念 • 概念：利用生物有机体(从微生物到高等动植物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种技术体系 • 内容：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程

3. 基因工程(genetic engineering)是对生物的遗传物质－核酸(nucleic acid)的分离提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术 大鼠生长激素基因转入小鼠

4. 细胞工程(cell engineering)是对生物的基本单位—细胞(有时也包括器官或组织)的离体培养、繁殖、再生、融合，以及细胞核、细胞质乃至染色体与细胞器(如线粒体、叶绿体等)的移植与改建等操作技术

5. 酶工程(enzyme engineering)是指利用生物有机体内酶所具有的某些特异催化功能，借助固定化(immobilization)技术、生物反应器和生物传感器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的一种技术； 发酵工程(fermentation engineering)，也有人称为微生物工程，是指给微生物提供最适宜的发酵条件生产特定产品的一种技术。

6. 第二节 园艺产品采后生物技术 一 、基因工程 • 植物基因工程的基本步聚包括：目的基因的克隆；目的基因的改造及改造型基因与载体DNA分子的体外重组；将重组DNA分子引入受体细胞；转化细胞的筛选与转基因植株的再生；转基因植株鉴定。 • 基本概括为：切、接、转、增、检

8. 二 反义基因技术 • 反义基因技术（antisense technique）是指将目的基因反向构建在一个启动子(promotor)上，再转化给受体植物，通过培育形成转基因植物，这种植物可能产生与该基因的mRNA互补结合的RNA链，成为反义RNA，其结果使植物中相应的mRNA的合成受阻

9. 反义技术的原理 　可能双链的RNA很快被核酸酶降解 或者反义RNA阻止了核糖体与正义RNA的结合

11. 根癌农杆菌介导的基因转移获得成功的水果

12. 根癌农杆菌介导的基因转移获得成功的水果

13. 根癌农杆菌介导的基因转移获得成功的蔬菜

14. 根癌农杆菌介导的基因转移获得成功的蔬菜

16. 转基因水果，你敢吃吗？

17. 转基因水果，你敢吃吗？

18. 转基因水果，你敢吃吗？

19. 细胞壁代谢相关酶及基因 • Le-EXP1 抑制表达的转基因果实，软化速率降低了15-20%，番茄果实的硬度明显高于对照 • Le-EXP1 过量表达的转基因番茄中，果实变小且更有弹性，软化加快 Le-EXP1 抑制表达 Le-EXP1 过量表达 对照和转基因番茄果实的硬度比较 The Plant Cell, 1999,11: 2203-2216

20. 通过转基因判断基因与果实成熟的关系 • 如正义转基因(不发生共抑制时)可促进果实成熟, 那么该基因是成熟相关基因. 但此类加强基因表达的研究开展得较少. 通常是某基因如可恢复该基因缺陷的成熟抑制突变体的成熟, 则认定为相关 • 反义转基因如可抑制果实成熟, 则该基因为成熟相关基因, 如不能抑制也不能完全排除该基因与成熟的关系, 而是暗示存在其它与成熟相关的未知的(更重要的)基因

21. 利用生物技术手段改善农产品贮运性 1991年转基因耐贮运番茄新品种培育成功（反义ACC合成基因）。1994年美国卡尔琴 ( Calgene ) 公司注册的FLAVR SAVRTM 番茄开始进入商品化生产，该番茄果实的货架期比普通的延长1-2个月。

22. 乙烯合成相关酶基因 　同野生型（右）比较，转反义ACC合成酶基因的番茄（左）抑制乙烯合成而延缓衰老

24. 乙烯合成相关酶基因 2 ACC氧化酶基因 • ACC氧化酶是一种与膜结合的酶，由多基因家族编码，在细胞中的含量比ACC合成酶还少 • 1990年，Hamilton采用反义RNA技术抑制ACC氧化酶活性，是世界上首例减少乙烯生成的转基因植株 • 转基因果实成熟期间的乙烯生成被严重抑制，其抑制程度与转入的反义基因数目有关，转入一个基因的，乙烯被抑制了87%，二个基因的则达97% 返回

25. 乙烯合成相关酶基因 转基因番茄果实的乙烯合成受到严重抑制 CK 转基因 转ACC氧化酶反义基因番茄果实的乙烯生成

26. 乙烯合成相关酶基因 转基因果实成熟期间的乙烯生成被严重抑制，其抑制程度与转入的反义基因数目有关 转不同反义基因数目番茄植株的ACC氧化酶活性比较(Hamilton et al, 1990)

27. 延长鲜花货架寿命的生物技术 • Lu等（1991）采用反义技术将ACC氧化酶基因导入香石竹植株，其乙烯生成量降低了90%，转基因植株花瓣的卷曲被抑制，鲜花货架寿命得以延长。但是这种花型比对照小，花瓣色素的合成量也降低。

28. 乙烯合成相关酶基因 3 ACC脱氨酶基因 • ACC脱氨酶能把ACC降解为α-酮基丁酸和氨 • Klee等（1991）将一种细菌ACC脱氨酶（该酶能分解ACC）基因正义转入番茄中 • 所得到的转基因番茄纯合子后代中果实的乙烯生成与对照相比，下降了97%，果实置于室温下4个月仍可维持一定硬度 返回

29. 乙烯合成相关酶基因 转ACC脱氨酶基因番茄果实的乙烯合成受到抑制 转ACC脱氨酶基因番茄果实后熟过程的乙烯生成 （Klee 等, 1991）

30. 乙烯合成相关酶基因 4 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）水解酶基因 • SAM是ACC的直接前体，S-腺苷甲硫氨酸水解酶（SAMase）能降SAM水解为5’甲硫氨酸（MTA）和高丝氨酸 • 表达SAM水解酶的转基因番茄果实与正常果实相比，果实的乙烯合成减少了80%，番茄红素含量下降，硬度增加， 延缓了果实的衰老，采后果实可贮藏3个月

31. 乙烯合成相关酶基因 转SAM水解酶基因不同株系番茄果实的乙烯合成减少了 野生型果实 转基因果实 转SAM水解酶基因不同株系番茄果实的乙烯生成（Good等，1994）

32. 五. 色素合成相关基因 • 叶绿素降解、类胡萝卜素和花青苷合成是成熟的主要内容之一 • 色素代谢通常在果实成熟前就已经开始，不是成熟的诱因，但受成熟和乙烯的促进 • 类似的色素代谢也发生在叶片衰老过程中，认为是果实发育后期的一个正常过程

33. 甜橙叶绿素酶基因在果实发育与成熟期间组成型表达, 但表达量低, 该基因的表达受乙烯强烈诱导，转色期的果实对乙烯尤为敏感。 • 反义抑制乙烯生成及成熟的番茄番茄红素积累受抑，表明类胡萝卜素代谢受乙烯合成调控(但不等同于受成熟调控, 因为衰老也受乙烯调控)。在非跃变型果实和叶片中，类胡萝卜素是始终存在的，只不过受果实成熟和/或果实及叶片衰老促进。 • 花青苷在果实成熟期间积累加强, 但成熟前也在积累, 表明是受成熟/衰老促进的过程。

34. 利用生物技术改变花色 矮牵牛 dif F基因中插入转座子后阻止了细胞色素b5的表达，花色发生了改变

35. 荷花的花色是由花色素基因控制合成的，在荷花花瓣发育过程中，当基因组中某一转座因子跳动，造成一些细胞中花色素合成基因的编码序列被打断时，基因失活后会导致花色素不能正常合成，花瓣中这些部位因此变成了白色。由于基因的转座现象常为嵌合型的，就会出现“一花两色”的情况荷花的花色是由花色素基因控制合成的，在荷花花瓣发育过程中，当基因组中某一转座因子跳动，造成一些细胞中花色素合成基因的编码序列被打断时，基因失活后会导致花色素不能正常合成，花瓣中这些部位因此变成了白色。由于基因的转座现象常为嵌合型的，就会出现“一花两色”的情况

36. 提高贮藏性和改善采后品质的转基因番茄 缓软番茄：反义PG (Nature, 1988) 不熟番茄：反义ACS (Nature，1990) 反义ACO (Science, 1991) 缓软番茄: 反义扩张蛋白 (Plant Cell, 1999) 高类胡萝卜素番茄：正义CrtI (Nature Biotech, 2000) 缓熟高品质番茄: 正义SAMDC (Nature Biotech, 2002)

37. 展望(存在的问题): • 果实成熟、果实衰老与乙烯三者之间的相互关系？ • 果实成熟是如何受发育阶段调控的？ • 果实成熟的系列事件发生次序及相互关系？ • 非跃变型果实的成熟机理？ • 众多成熟相关基因的功能？ • 同一时期同一组织表达的多基因家族成员具不同功能的原因？ • 如何充分利用分子生物学新技术(如Microarray)及生物信息学技术(如EST库)来深入及更新采后分子生物学研究内容? • 木本多年生果树无法应用转基因技术，如何研究哪些基因与成熟存在因果关系？

38. 2.5.2农产品转基因技术存在的问题及展望 • 生物安全性问题 人们担心遗传饰变生物(genetic modified organisms，GMOs) 及其产品可能对生态系统、 物种和天然基因等造成不利影响，损害人体健康 • 转基因食品的安全性问题 人们主要对转基因食品潜在的过敏性、食品毒性以及转基 食品的非预期效应问题，转基因食品基因水平传递对健康 的影响，转基因食品营养成分改变对人群膳食营养的影响 等问题的担心和疑虑。

39. 1996年巴西豆过敏事件：1996年由于巴西豆基因转入大豆，引起部分人过敏，该项研究被终止。1996年巴西豆过敏事件：1996年由于巴西豆基因转入大豆，引起部分人过敏，该项研究被终止。 1998年英国转基因土豆试验：用转基因土豆连续饲喂大鼠，大鼠器官生长异常，体重减轻，免疫系统遭到破坏。 1999年美国斑蝶事件：转基因抗虫玉米的花粉撒在一种植物叶片上，喂养黑脉金斑蝶，4天后幼虫死亡率达44%。 2000年“星联”转基因玉米回收事件：2000年10月，一种名为“星联”的转基因玉米被发现混入了加工食品中，由于“星联”玉米可能导致部分人皮疹、腹泻或呼吸系统的过敏反应，而且只被批准做动物饲料，因此引发全球的回收潮，涉及300多种含有玉米的食品。 引起转基因食品安全性争议的深层原因

40. 我国转基因食品发展概况 • 我国转基因食品的发展，一方面要归功于我国转基因植物的研究与应用所取得的成就；另一方面，我国转基因食品的发展与世界转基因植物的发展密切相关。 • 我国是世界上第一个商品化种植转基因作物(genetically modified crop，简称GMC )的国家，从1992年我国首次种植抗黄瓜花叶病毒(CMV)和抗烟草花叶病毒(TMV)双价的转基因烟草；至1996年，国内研究与开放的转基因植物达47种，涉及各类基因103种。自1997年至2004年，我国农业部批准安全评价申请环境释放243项，生产性试验108项。已进入环境释放阶段的转基因植物有:水稻、玉米、小麦、马铃薯、河套密瓜、番木瓜、大豆、油菜、烟草、、黑麦草等；已商业化的转基因作物有58项：棉花(46项)、线辣椒(1项)、甜椒(4项)、矮牵牛(1项)、番茄(6项)。

41. 我国转基因食品发展概况 • 从我国转基因食品原料的生产看，除转基因棉花有一定的规模外，其余象水稻、油菜等作物虽已具有产业化水平，都是在小范围种植，进入商品化生产的较少。我国的转基因食品主要是利用从转基因作物生产大国美国、加拿大、阿根廷、巴西等国进口转基因大豆、玉米、油菜籽等为原料加工成的食品。1996年我国进口的转基因大豆为8万吨，到2004年进口量大1500万吨；近年来，我国平均每年从加拿大进口油菜籽100 多万t，最多时达300 万t， 进口的油菜籽中60%以上是转基因油菜籽； 进口转基因玉米：2002年585万t，2004年720万t。所以，我国消费者每年消费的转基因食品总量在2000万吨以上。

42. 对待转基因生物的两种观点 • 支持方观点：转基因生物和常规育种得到的品种是一样的，两者都是在原有基础上对某些性状进行修饰，或增加新性状，或消除原有的不利性状。有意识的杂交育种已经有l00多年的历史了，对常规育种的品种不要求安全性评价，为什么对转基因植物要进行安全性分析? • 谨慎方观点：常规育种有性杂交仅限于种内或近缘种间，而转基因植物中的外源基因可来自植物、动物和微生物，人们对可能出现的新的组合、新的性状会不会影响人类健康和生态环境，还缺乏足够的知识和经验，按目前科学水平还不可能完全精确地预测一个外源基因在遗传背景中会产生什么互作效应？

43. 我国对生物安全管理的五项基本原则 • 1)现代生物技术与生物安全协调发展的原则； • 2)预防为主、防治结合的原则； • 3)根据生物技术及其产品的危害程度实行分级管理、区别对待的原则； • 4)跨国越境转移(GMOs及其产品时实行提前知情同意的管理程序和损害赔偿的原则； • 5)部门协调合作的原则。

44. 我国相继出台的法律文件 • 《农业转基因生物安全管理条例 》：自2001年5月23日起实行。共包括八章56条 • 《农业转基因生物进口安全管理办法》 ：自2002年3月20日起施行 。共包括五章21条 • 《农业转基因生物标识管理办法》：自2002年3月20日起施行。共包括16条 • 《转基因食品卫生管理办法》：自2002年7月1日起施行。共包括六章26条

45. 国际社会对植物转基因食品安全性的关注 • 1)公众对植物转基因食品安全性的反响：上个世纪末，由转基因食品安全性引发的公众对抗性事件屡有发生。1998年11月孟山都公司在印度的两块转基因试验田被烧；法国毁掉转基因油菜；英国发生了狂摔超市内的转基因食品事件。在法国还曾经出现将转基因水果、蔬菜等同牛粪混在一起扔到快餐店门前的事件，以抗议店主出售的牛肉、面包和马钤薯中含转基因生物成分。在日本，克隆牛肉一面市就引起了公众反对，要求生产和销售者必须标明转基因食品的身份。有的人甚至冲击国际生物安全会议、质问会议代表、干扰会议活动。

46. 对转基因植物及其产品持反对态度的人认为，这类产品是人类自己创造而又无法控制的食品，在其长期安全性和对环境影响没有得到科学证明无害之前，政府应对转基因植物的种植作出限制性规定。各种媒体也争相炒作，有的甚至指责科研人员，声讨转基因食品。对转基因植物及其产品持反对态度的人认为，这类产品是人类自己创造而又无法控制的食品，在其长期安全性和对环境影响没有得到科学证明无害之前，政府应对转基因植物的种植作出限制性规定。各种媒体也争相炒作，有的甚至指责科研人员，声讨转基因食品。 • 澳大利亚民意测验结果显示，65%的人不愿意让转基因食品进入自己的食谱；93%的人主张强制性地给转基因食品贴上特种标识，注明基因来源、成分含量，供消费者自愿选择；法国66%的人认为转基因食品对人类健康有害，英国只有14%的人表示愿意接受转基因食品。在美国、加拿大的市场上已销售转基因食品10年之久，绝大多数人尚能接受，但仍有少数人认为食用转基因食品可能对人体健康有害。

47. 国际社会对植物转基因食品安全性的关注 • 2)国际社会对植物转基因食品安全性的关注 ：FAO／WHO于1990和1996年分别召开了联合专家咨询会议。在1990年的会议上，联合专家咨询委员会经过充分论证提出了转基因食品安全评价程序。1999年以后，世界各国对转基因食品安全性更加重视，组织了一系列有关转基因食品安全问题的专家会议。2000年5月在日内瓦、2001年1月25日在罗马分别召开的FAO／WHO专家联席会议上，进一步确定了评价转基因食品安全性与营养价值的基本原则；进一步讨论了转基因植物过敏性问题，并修改了转基因植物潜在过敏性评价草案。

48. 国际社会对植物转基因食品安全性的关注 • 3)各国政府对转基因食品的管理： 关于转基因食品的安全性问题，欧洲国家反响最为强烈。早在1998年欧盟就暂停批准15个成员国经营转基因食品，英国除严格信守欧盟暂停种植转基因植物的规定外，还将限制范围扩大到食品厂、餐馆、咖啡屋、零售食品店和比萨饼店等，外卖转基因快餐也必须标明所含的转基因成分，否则将处以高达5 000英镑的罚款。英国首相布莱尔认为只有对转基因植物安全性做出正确判断后，在英国才能投入商业种植。

49. 国际社会对植物转基因食品安全性的关注 • 3)各国政府对转基因食品的管理： 加拿大于1995年发布了《新食品资源法》和《新食品安全评价指南》，对通过生物技术生产的食品实施安全管理，并实行审批制度；法国早就开始了对转基因食品成分含量检测的准备工作，如法国农业科学研究院、反走私局和部分大型食品企业等都建立了检测食品中转基因成分的实验室。德国制定了《基因法》，由中央科学研究院负责生物安全管理。2000年以后，欧盟的政策有些松动，不再停止审批；但要进行严格的安全审批和规范管理，实施标识制度。

50. 国际社会对植物转基因食品安全性的关注 • 3)各国政府对转基因食品的管理：美国是培育转基因植物和销售转基因食品最多的国家，其中60%以上的零售食品都含有转基因成分，估计今后几年转基因食品将充斥美国的整个食品供应体系。因此，1999年6月在华盛顿举行的全国专家会议上，美国政府第一次正式提出在转基因食品包装上加注标签的规定。 日本采取介于美国和欧盟之间的管理模式，既不宽松,也不严格，由日本科技厅、农林水产省和厚生省共同管理，从2000年4月起，对转基因产品实行标识制度，制定了《转基因食品的标准值内容及实施办法》。俄罗斯对转基因食品反应比较迟钝，从1999年7月1日起才开始对转基因食品建立州政府登记制度。