Complex Oxidative Stress Response to Polycyclic Aromatic Hydrocarbon in A. thaliana

1. An oxidative stress response to polycyclic aromatic hydrocarbon exposure is rapid and complex in A. thaliana Plant Science, 2009 Cólon-Carmona Lab - University of Massachusetts Boston, USA

2. Resumo • HPA foram uma classe de compostos orgânicos carcinogênicos cancerígenos e são candidatos atrativos para a fitorremediação • Plântulas de Arabidopsis foram tratadas com fenantreno para entender em detalhes os mecanismos de stress oxidativo • A atividade de das enzimas antioxidantes SOD, POD, CAT e APX, assim como H2O2, GSH e o produto da oxidação lipídica malondialdehyde (MDA) foram medidos no tecido foliar após 30 dias de tratamento com fenantreno de 0.25-1.25 mM • SOD teve sua atividade aumentada • CAT permaneceu praticamente inalterada • POD e APX exibiram pico em 0.25 mM e declinaram em concentrações mais altas • H2O2, GSH e MDA aumentaram com fenantreno e o DAB mostrou-se dose-dependente da acumulação de H2O2

3. Resumo • Os níveis de RNAm de APX1 e CAT2 foram medidos em 6 pontos durante 72h de fenantreno a 1mM : APX1 - 48h e CAT2- 12h • Os níveis de clorofila a e b caem com o aumento da concentração de fenantreno • A microscopia eletrônica de transmissão revelou que cloroplastos e mitocôndrias ficam deformados e estruturam celulares colapsaram • Isto mostra que estresse oxidativo é um componente importante da resposta aos HPA em plantas

4. Materiais e Métodos 1.Plantas Fenantreno em metanol 100 mM em MS 1/2 (2% de sacarose, 0,8% de fitoagar, pH 6) em concentrações finais de 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1 e 1.25 mM Esterilização: etanol 75% e 10% de hipoclorito de sódio Ecotipo Columbia - sementes 3d a 4oC e transferidas para 23oC, fotoperíodo16/8h As sementes germinadas foram contadas e o crescimento das plântulas monitorado Os parâmetros fisiológicos foram medidos 30 dias após os experimentos terminados As folhas das plantas foram coletadas no meio do dia, congeladas em N2liq e estocadas a -80oC até o ensaio

5. Materiais e Métodos Para os ensaios de RNAm as plântulas foram crescidas por 11 dias e transferidas para o meio com 1mM de fenantreno ( uso de controle) Os tecidos foliares foram coletados após 4, 6, 8, 12 e 72h de plantas controle e em fenantreno Também coletadas ao meio-dia, congeladas em N2 e estocadas -80oC ? 2. Parâmetros fisiológicos Tecidos foliares (0.2-1g) foram homogenizados mm PBS gelado (50mM pH7) contendo 1% PVP Centrifugados a 10,000 rpm 4oC por 10 min O Sobrenadante foi usado imediatamente para determinar as atividades de SOD, POD, CAT, MDA e proteínas.

6. Materiais e Métodos • A atividade de SOD foi determinada por NBT em 560 nm • POD: metódo guaiacol (mistura de 3 mL contendo guaiacol 20mM, 100mM PBS, 20uL de H2O2 30% (m/v) e 80uL de extrato enzimático) a 470 nm • CAT: perseguindo a diminuição da absorbância a 240 nm ( método UV) • MDA: thiobarbituric acid colorimetry (? Hodges 48) • Proteína: Comassie blue • APX: perseguindo a diminuição da absorbância a 290 nm ( método UV). Folhas (0.5g) foram homogeneizadas em 5 mL de extrato enzimático (pH 7.8) contento 50mM PBS, 15mM EDTA, 12mM ascorbato • centrifugação a 8000 rpm a 4oC por 15 min -> o sobrenandante foi utilizado para determinar a atividade de APX • Mistura para o ensaio (1mL): 50mM PBS (pH7), 0.1 mM EDTA, 0.5 mM Ascorbato, extrato enzimático e 0.8 mM de H2O2

7. Materiais e Métodos • Conteúdo de GSH • 0.5g de folha por DTNB (Guo35) • Abs a 412nm • Conteúdo de clorofila • 0.2g de folha (Guo35) • Abs a 663, 646 e 470 nm • Conteúdo de H2O2 • 0.5g de folha (Guo35) • Absorbância foi medida a 410nm DAB: folhas de 14 dias de estresse foram imersas em solução de DAB (pH7) overnight e descoloridas em etanol 100% por 3h TODOS OS EXPERIMENTOS FORAM REALIZADOS EM QUADRUPLICATA

8. Materiais e Métodos 3. MET Folhas de 16 dias : fixação em gluta, desidratação em série de etanol e lavado em acetona e polimerizados em epon Cortes de 70-80nm e marcados por acetado de uranila e citrato de chumbo Jeol 1200 4. qRT-PCR Extração em trizol cDNA por kit Invitrogen Kit Sybr premix Gene de referência ACT7 Genes CAT2 (?) e APX1 5.Análises estatísticas: 3-25 replicatas (ANOVA- SPSS software)

9. Resultados 1.Efeito nas plântulas Taxa de germinação e tamanho da raiz diminuíram com o tratamento com fenantreno 1mM por mais de 11 dias (Fig1)

10. Resultados Raízes ficaram deformadas e com auxiliares após 30 dias de exposição a fenantreno 0.5mM (dados não mostrados) Os efeitos fisiológicos aumentam com o aumento da concentração de fenantreno (Fig2) Com fenantreno a 1mM algumas plântulas morreram a partir do dia 19

11. Resultados 2. Mudanças no conteúdo de clorofila e na ultraestrutura celular Os níveis de clorofila a e b caíram com o aumento das concentrações de clorofila após 30 dias (Fig3)

12. Resultados Após 16 dias de tratamento com 1mM de fenantreno os cloroplastos perdem a forma e as lamelas se toram menos distintas. Além disso as mitocôndrias e outras organelas não são distinguíveis, consistente com danos membranares Algumas células colapsaram e tanto cloroplastos quanto mitocôndrias não são distinguíveis (Fig4)

13. Resultados 3. Enzimas Figura 5: Plantas com 30d Diferenças significativas da atividade de SOD são detectadas ente 0.75, 1.0 e 1.25mM de fenantreno A atividade de CAT foi essensialmente inalterada, mas sugerindo decaimento Todos os níveis de fenantreno induzem as atividades de POD e APX, com atividade máxima a 0.25mM

14. Resultados

15. Resultados 4.qRT-PCR CAT2 e APX1 (folhas) foram medidos em 5 pontos entre 0 e 72h com 1mM de fenantreno (Fig6) CAT2 desapareceu com 12h e continuou reprimido APX1 aumenta com 12-24h e atinge seu ponto máximo em 48h

16. Resultados 5.GSH Os níveis de GSH aumentam com a concentração de fenantreno Fig 7

17. Resultados 6. H2O2 Plantas de 30 dias (fig8) DAB: tecidos foliares de 14 dias

18. Resultados 7. MDA Fig8b