1 / 35

Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej

Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej. dr n. med. Jacek Tabarkiewicz (tabar@mp.pl). KOMÓRKI DENDRYTYCZNE. Profesjonalne komórki prezentujące antygen, rozmieszczone w większości tkanek organizmu.

libitha
Download Presentation

Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Komórki dendrytyczne – subpopulacje i oznaczanie za pomoca cytometrii przepływowej dr n. med. Jacek Tabarkiewicz (tabar@mp.pl)

  2. KOMÓRKI DENDRYTYCZNE Profesjonalne komórki prezentujące antygen, rozmieszczone w większości tkanek organizmu Odkryte w 1868 r. przez Langerhansa na podstawie reakcji z solami złota Scharakteryzowane na podstawie kształtu, lokalizacji, panelu antygenów powierzchniowych oraz cech funkcjonalnych, Zaangażowane w większość oddziaływań miedzykomórkowych • rozpoczynają odpowiedź komórkową, stymulując limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne • pobudzają odpowiedź humoralną i produkcję przeciwciał • wspomagają funkcję komórek odporności nieswoistej • zapewniają tolerancję immunologiczną

  3. SZPIK KOSTNY PREKURSORY KRĄŻENIEKREW PREKURSORY - NIEDOJRZAŁE MIELO- I LIMFOIDALNE DCs NIEDOJRZAŁE DCs - „wartownicy spokoju immunologicznego” TKANKI NACZYNIA LIMFATYCZNE DOPROWADZAJĄCE DOJRZEWAJĄCE DCs po kontakcie z antygenem NARZĄDY LIMFATYCZNE DOJRZAŁE DCs WĘDRÓWKA KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W LUDZKIM ORGANIZMIE

  4. KRĄŻENIE MIELOIDALNE DCs CMP (common mieloid progenitor) CD34, CD33, CD11c HSC (HEMATOPOETYCZNA KOMÓRKA PNIA) CLP (common lymphoid progenitor) LIMFOIDALNE DCs CD34, CD45RA, CD10, IL7R SZPIK KOSTNY

  5. Subpopulacje a immunofenotyp komórek dendrytycznych Immunology Today Vol.21 No. 9 Sep. 2000

  6. Subpopulacje a immunofenotyp komórek dendrytycznych TRENDS in Immunology Vol.22 No. 1 jan. 2001

  7. ZMIANA FENOTYPU KOMÓREK DENDRYTYCZNYCH W TRAKCIE DOJRZEWANIA WELONOWATE DCs CD80 CD83 CD86 CCR7 PREKURSORY SZPIKOWE NIEDOJRZAŁE DCs FcγRI FcγRII CD68 CCR1 CCR4 CCR5 CXCR4 DOJRZAŁE DCs CD54, CD58 CD80, CD86 CD83, CD40L DC-LAMP CCR7

  8. Metoda oznaczanie komórek dendrytycznych jako komórki Lin-/CD11c+/HLA-DR+ lub Lin-/CD123+/HLA-DR+ • Stosujemy koktajl następujących przeciwciał sprzężonych z FITC: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56 – które znakują nam limfocyty, monocyty, neutrofile i eozynofile – komórki Lin+

  9. Metoda z użyciem koktajlu przeciwciał monoklonalnych • 1. Dla oznaczenia mieloidalnych DC używa się przeciwciał monoklonalnych: anty-CD14, anty-CD16 FITC, anty-CD33 PE oraz anty-HLA-DR CyChrome. Za mieloidalne komórki dendrytyczne uznaje się komórki o immunofenotypie CD14-, CD16-/CD33+, HLA-DR+. • 2. Dla oznaczenia limfoidalnych DC używa się przeciwciał monoklonalnych: anty-CD3, anty-CD11c, anty-CD14, anty-CD16, anty-CD19 FITC, anty-CD4 PE oraz anty-HLA-DR CyChrome. Za limfoidalne DC uznaje się komórki o immunofenotypie CD3-, CD11c-, CD14-, CD16-, CD19-/CD4+, HLA-DR+

  10. Mieloidalne DC: CD16-,CD14-/CD33+,HLA-DR+

  11. Mieloidalne DC: CD16-,CD14-/CD33+/HLA-DR+ R3=0.18%

  12. Limfoidalne DC: CD3-,CD11c-,CD14-,CD16-,CD19-/CD4+/HLA-DR+

  13. Limfoidalne DC: CD3-,CD11c-,CD14-,CD16-,CD19-/CD4+,HLA-DR+ R3=0.10%

  14. Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia komórek dendrytycznych lini mieloidalnej używa się przeciwciał anty-CD19 i anty- BDCA-1 (CD1c). Komórki o immunofenotypie CD19- i BDCA-1+ odpowiadają mieloidalnym DC. Komórki BDCA-1+ wykazujà ekspresję nastepujących antygenów: CD4+, Lin-, CD11cbright, CD123dim, CD45RO+, CD2+, CD13+, CD33+, CD32+, CD64+ oraz HLA-DR+. Stanowią średnio ok. 0,3% leukocytów krwi obwodowej.

  15. Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia komórek dendrytycznych linii limfoidalnej/plazmacytoidalnej używa się przeciwciał anty BDCA-2 (CD303)i CD123. Limfoidalnym DC odpowiadają komórki o immunofenotypie BDCA-2+ i CD123+. Komórki BDCA-2+ wykazują ekspresję CD4+, Lin-, CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2-,CD13-, CD33-, CD32-, CD64- oraz HLA-DR+ Stanowią średnio ok. 0,4% leukocytów krwi obwodowej.

  16. Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek dendrytycznych linii mieloidalnej można użyć przeciwciał anty BDCA-3 i CD14 PE. Komórki te wykazują następujący immunofenotyp CD4+, Lin-, CD11c dim, CD123-, CD45RO+ and CD2-, CD13, CD33. Nie wykazują ekspresji receptorów Fc: CD32, CD64 i FcεRI. BDCA-3 może występować w niskiej ekspresji na monocytach, plazmocytoidalnych DC: BDCA-2+ BDCA-4+ i także komórkach CD1c (BDCA-1)+. Stanowią średnio ok. 0,02% leukocytów krwi obwodowej.

  17. Oznaczanie krążących komórek dendrytycznych za pomocą przeciwciał anty-BDCA firmy Miltenyi Biotec Do oznaczenia kolejnej subpopulacji komórek dendrytycznych linii limfoidalnej można użyć przeciwciał anty BDCA-4 (CD304/Neuropilin-1) FITC i CD123 PE. Odpowiadają komórki o immunofenotypie BDCA-4+ i CD123+. Komórki BDCA-4+ wykazują immunofenotyp: CD4+, Lin-, CD11c-, CD123bright, CD45RA+, CD2-, łańcuch α pre-TCR i BDCA-2+. Ich ilość we krwi obwodowej jest zbliżona do komórek BDCA-2+ (CD303)+.

  18. BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+ komórki dendrytyczne – krew obwodowa

  19. BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – zapalny płyn stawowy (MIZS)

  20. BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – przerzutowe węzły chlonne (rak płuca)

  21. BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – tkanka nowotworowa(rak płuca)

  22. BDCA1+\CD19- i BDCA-2+\CD123+komórki dendrytyczne – płyn opłucnowy(rak płuca z przerzutami do opłucnej)

  23. BDCA3+\CD14- i BDCA-4+\CD123+ komórki dendrytyczne krew obwodowa

  24. Problemy z interpretacją wyników

  25. Kliniczne zastosowanie szczepionek z DCs Nowotwór Ilość prób klinicznych Chłoniak 2 Szpiczak 9 Białaczki 8 Czerniak 21 R. piersi 12 R. jajowodu 1 R. pęcherza 1 R. pęcherza 26 R. nerki 18 Guzy z ekspresją CEA 1 R. przytarczyc 1 R. tarczycy 3 R. przełyku 1 R. żołądka 2 R. j. cienkiego 2 R. j. grubego 10 R. wątroby 4 R. płuca 7 R. trzustki 8 Nowotwory U.N. 11 R. Nosogardzieli 1 Różne 2 HIV 4 HBV 1

  26. Wykorzystanie szczepionek z DCs w innych schorzeniach Choroby autoimmunizacyjne Infekcje wirusowe Infekcje bakteryjne Choroby pasożytnicze Choroby alergiczne

  27. W immunoterapii używamy najczęściej komórek dendrytycznych wygenerowanych z monocytów krwi obwodowej. Do ich immunofenotypowania używamy najczęściej przeciwciał anty: CD14, CD45, CD1a, CD83, CD80, CD86, HLA-DR.

  28. CZĘŚĆ PRAKTYCZNA • W całej procedurze używamy buforu do DC składającego się z PBS (bez jonów Ca2+ i Mg2+) wzbogaconego 0,5% BSA i 2mM EDTA. • Używamy chłodnego buforu, a inkubację i płukanie przeprowadzamy w 4C

  29. Dodajemy 20l FcR Blocking Reagent • Dodajemy 10l przeciwciał anty-BDCA-1 lub anty BDCA-2 • Zawieszamy 10x107 komórekw 80l buforu • Dodajemy odpowiednie ilości pozostałych przeciwciał • Przeprowadzamy 10 min inkubacje w 4C • Dodajemy 1-2ml buforu na każde 10x107 komórek i wirujemy przez 10 min. z przyśpieszeniem 300xg w temperaturze 4C • Zlewamy supernatant i przeprowadzamy analizę cytometryczną

  30. Do powstania prezentacji przyczynili się: • mgr Sebastian Radej • dr n. med. Agata Surdacka • mgr Magdalena Wasiuk • mgr paulina Wdowiak • dr n. med.. Kamila Wojas-Krawczyk

More Related