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Presentation Transcript

  1. Atresia das vias biliares extra-hepáticas: Expressão gênica em um modelo experimental Autora: Elisa de Carvalho Brasília - 2005 Orientador: Luiz Alberto Simeoni Co-orientador: Jorge A. Bezerra Universidade de Brasília Cincinnati Children's Hospital Medical Center

  2. I - Introdução

  3. AVBEH: principal indicação de transplante hepático

  4. AVBEH: principal indicação de transplante hepático AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions. Summary of a symposium. Hepatology 23, 1682-1692 (1996). Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa monta de indicação para o transplante.

  5. AVBEH Complicações da portoentorostomia Complicações da doença Colangite Colestase Progressão da hepatopatia ? Hipertensão portal Cirrose biliar Varizes esofagogástricas Hiperesplenismo Ascite Insuficiência hepática Síndrome hepatopulmonar Síndrome heparorrenal

  6. Terapêutica: portoenterostomia

  7. Evolução pós-portoenterostomia Diagnóstico tardio

  8. Etiopatogênese ?

  9. Etiopatogênese Embrionária Perinatal 20 % 80 %

  10. Histologia das vias biliares

  11. Obstrução progressiva das VBEH

  12. Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A PHILLIPS, P. A. et al.Chronic obstructive jaundice induced by Reovirus type 3 in weanling mice. Pathology 1, 193-203 (1969). SCHMELING, D. J. et al. Experimental obliterative cholangitis. A model for the study of biliary atresia. Ann. Surg. 213, 350-355 (1991). RIEPENHOFF-TALTY, M. et al. Group A rotaviruses produce extrahepatic biliary obstruction in orally inoculated newborn mice. Pediatr. Res. 33, 394-399 (1993). PETERSEN, C. et al. New aspects in a murine model for extrahepatic biliary atresia. J. Pediatr. Surg. 32, 1190-1195 (1997). Camundongos Balb/c

  13. Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A Indução: AVBEH Idade do animal < 12 horas Camundongos Balb/c Carga viral Modelo animal: bem estabelecido, como adequado para pesquisas experimentais relacionadas à atresia. 106 PFU/mL Via de inoculação Intraperitoneal

  14. Modelo animal: AVBEH Rotavírus rhesus do grupo A RRV Expressão gênica Fator inicial: Infecção Camundongos Balb/c Inflamação e fibrose obliterante As modificações da expressão gênica comandam os processos biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial.

  15. Hipótese do estudo Genoma Inoculação de RRV Ativação ou desativação reacional de genes Reprogramação da função celular (Estimulação ou inibição de processos biológicos) Fibrose progressiva com obliteração das VBEH

  16. II - Objetivos

  17. Objetivo geral Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extra-hepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da evolução dessa doença.

  18. Objetivos específicos Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes estágios da obstrução biliar. Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas. Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a obliteração das vias biliares extra-hepáticas.

  19. III - Métodos

  20. Desenho do estudo Estudo experimental, randomizado e controlado.

  21. 114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida filhos de mães negativas para o RRV Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL) primeiras 24 horas de vida Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH. Grupo B (grupo controle): 51 camundongos Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%, primeiras 24 horas de vida.

  22. 102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida) Inoculação intraperitoneal com RRV Inoculação intraperitoneal com SF 0,9% Grupo B: 51 camundongos (grupo controle) Grupo A: 51 camundongos (modelo animal de AVBEH) Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal Laboratorial: bilirrubinúria Anestesia: Microdissecção e ressecção das vias biliares Retirada de dois fragmentos hepáticos Animais sacrificados com: 03 dias de vida:subgrupos A1 e B1 07 dias de vidasubgrupos: A2 e B2 14 dias de vida subgrupos: A3 e B3 03 amostras RNA: Microarranjos 03 amostras RNA: RT PCR 03 amostras Histologia: VB Dia 3 Dias 7 e 14 Amostra 01 Amostra 01

  23. Avaliação da expressão gênica Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Reação em cadeia da polimerase em tempo real Novas tecnologias GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de “funcionamento” de todos os genes em um momento específico - níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio. RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão gênica.

  24. Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene específico.

  25. Extração: RNA das vias biliares Homogeneização e lise celular(TRIzol) Fase da separação (fenol/clorofórmio) RNA Lipídeos Carboidratos Proteínas Precipitação (isopropanol) RNA RNA TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA

  26. Qualidade do RNA

  27. Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip® Local de origem do sinal de fluorescência e a intensidade deste identifica o gene em questão e seu nível de expressão.

  28. Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip® Unidade de expressão: pixel

  29. Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring

  30. Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras. Comparação entre os grupos experimental e controle. Avaliação estatística. Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology).

  31. GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou normalizado) em relação ao controle. Segunda etapa: As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal. A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado separadamente para os dias 3, 7 e 14. Primeira etapa: Média de todos os sinais da expressão gênica. Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente. Objetivo: evitar valores extremos. Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

  32. GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

  33. GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

  34. GeneSpring Seleção estatística dos genes e dos processos biológicos Reclassificação dos genes (PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank) Seleção dos processos biológicos (Anova p < 0,05) Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo (Diagrama de Venn) Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle Seleção dos genes (Anova p < 0,01) Normalização Grupo experimental X Grupo controle (Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)

  35. Validação dos resultados do GeneChip Reação em cadeia da polimerase em tempo real

  36. RT PCR: Quantificação do número de cópias Sinal de fluorescência: SYBR Green

  37. Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras

  38. Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT Platô Linha que delimita o nível de detecção do sinal de fluorescência Amostra Fluorescência emitida Threshold Amostra: sem DNA Região da linha de base CT Número de ciclos Quantidade de cópias inicial da amostra

  39. Cálculo da expressão gênica Expressão de um gene Quantidade de cópias do gene-alvo Quantidade de cópias do gene padrão Variação da expressão Expressão do gene no grupo experimental Expressão do gene no grupo controle Gene padrão: 18S. Animais do grupo experimental e do controle.

  40. Especificidade dos microarrranjos: árvore biliar extra-hepática Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7): Fígado e árvore biliar extra-hepática Validação: RT PCR

  41. IV - Resultados

  42. Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV 63 camundongos AVBEH: 51 camundongos (81%) Outros estudos: 67% a 86% Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001; Shivakumar P et al., 2004

  43. Evolução da infecção pelo RRV Icterícia Colúria Acolia fecal AVBEH: quadro clínico Ausência: Quadro diarréico X Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005) Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994)

  44. Camundongos RRV: tropismo pelos colangiócitos Brevidade cronológica Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal (Shivakumar et al., 2004)

  45. De modo similar em humanos: Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos. BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J. Pediatr. 106, 171-184 (1985). BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic syndromes of infancy and childhood. Semin. Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001). Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa doença.

  46. Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas Vesícula biliar distendida . Vesícula biliar pequena e contraída. Vias biliares de aspecto normal. Vias biliares estreitas e fibrosadas.

  47. Avaliação histológica das vias biliares Grupo controle Dia 14 Dia 3 Dia 7 Grupo experimental Dia 3 Dia 7 Dia 14 Barra preta: 100 μm

  48. Peso médio dos camundongos SF 0,9% RRV * * * * * * * * Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14.

  49. Modelo animal: Idade Sinais clínicos Aspectos macroscópicos Histologia Evolução ss Hipodesenvolvimento: Redução da ingesta alimentar Esteatorréia Fenótipo da AVBEH em crianças