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Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con l’impiego di microchip

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Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con l’impiego di microchip. Enrico Tortoli. Le resistenze del bacillo tubercolare. cromosomiche sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10 -5 e 1x10 -6

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Presentation Transcript
sensibilit ai farmaci del micobatterio tubercolare approccio genotipico con l impiego di microchip

Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con l’impiego di microchip

Enrico Tortoli

le resistenze del bacillo tubercolare
Le resistenze del bacillo tubercolare
  • cromosomiche
  • sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10-5 e 1x10-6
  • selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie incongrue
mdr tb
MDR-TB
  • letalità superiore al 40%
  • altissima incidenza nei paesi in via di sviluppo
  • il genotipo Beijing
l antibiogramma tradizionale
L’antibiogramma tradizionale
  • metodo delle proporzioni
    • su Lowenstein-Jensen: 28-42 gg
    • su 7H10/11: 10-21 gg
    • in terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 gg
i farmaci antitubercolari maggiori
I farmaci antitubercolari maggiori
  • ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolici
  • RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica
  • PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con l’isoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto
  • ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica della parete
  • STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica
mutazioni e resistenze
Mutazioni e resistenze
  • nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni geniche
  • per nessun farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze
  • in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro
isoniazide i
Isoniazide I
  • è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, l’attività catalasica è ridotta o assente
  • tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel gene katG (gene della catalasi-perossidasi)
  • circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene katG
  • l’attività battericida dell’isoniazide si manifesta soltanto in seguito all’ossidazione del farmaco operata dell’enzima catalasi-perossidasi
  • circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC codificante per una alchil-idroperossido reduttasi
  • l’introduzione del gene katG wild-type in mutanti isoniazide-resistenti ripristina la sensibilità al farmaco
isoniazide ii
Isoniazide II
  • circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide; le mutazioni sono responsabili di over-espressione del gene
  • mutazioni del gene kasA, codificante una proteina che regola l’allungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere il bersaglio dell’isoniazide
  • MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. micolici
rifampicina
Rifampicina
  • oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpoB codificante per la subunità  della RNA-polimerasi
  • le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA
etambutolo
Etambutolo
  • il 50% circa dei ceppi resistenti all’etambutolo presentano mutazioni nel gene embB, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi
  • le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dell’arabinano nei polisaccaridi della parete, costituiscono il bersaglio dell’etambutolo; in caso di mutazione si ha over-espressione
pirazinamide
Pirazinamide
  • la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi
  • oltre l’80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene pncA codificante per la pirazinamidasi
streptomicina
Streptomicina
  • alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12
  • altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S
  • le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dell’antibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica
  • nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentI
metodi genotipici di ricerca delle resistenze
Metodi genotipici di ricerca delle resistenze
  • ricerca delle mutazioni associate con le resistenze
    • sequenziamento genico
    • Single Strand Conformation Polymorphism
    • Restriction Fragment Lenght Polymorphism
    • ibridizzazione in fase solida
    • formazione di eteroduplex
  • tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni
microarray
Microarray
  • sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di una matrice, catene di ac. nucleico
  • microchip: microarray commerciale, preconfezionato, in cui le singole postazioni possono, o meno, essere controllate elettronicamente
  • identificazione, in fasi successive, delle eventuali mutazioni presenti in una determinata regione geniche di vari ceppi (amplicon down)
  • identificazione di una specifica mutazione in molti ceppi contemporaneamente (capture down)
amplicon down
Amplicon down
  • mancata ibridizzazione = probabile resistenza, da confermare cimentando in successione sonde con differenti mutazioni fino al raggiungimento dell’ibridazione (possibilità di usare coppie di sonde marcate con differenti fluorocromi)
  • legame, a vari microelettrodi, degli amplificati della regione in esame ottenuti da altrettanti ceppi
  • aggiunta di una sonda wild-type marcata
  • ibridizzazione = sensibilità

impiego di numerose sonde per ciascuna regione da monitorare

capture down
Capture down
  • legame ai vari microelettrodi di varie sonde, ciascuna specifica per una diversa mutazione della regione genica di interesse
  • aggiunta dell’amplificato in esame
  • aggiunta di una nuova sonda (marcata), specifica per un tratto privo di mutazioni della regione amplificata
  • rivelazione dell’amplificazione grazie alla marcatura

impiego di numerosi microelettrodi per ciascuna regione da monitorare

eteroduplex
Eteroduplex
  • legame, a ciascun microelettrodo, dell’amplificato di un ceppo in esame
  • aggiunta di una sonda wild-type
  • aggiunta una proteina di E. coli, implicata nei meccanismi di riparazione del DNA, che ha la caratteristica di legarsi alle doppie catene di ac. nucleico che presentano mismatch
    • legame = eteroduplex = resistenza
    • assenza di legame = duplex omogeneo = sensibilità

impiego di una sola sonda e di un singolo microelettrodo per ciascuna regione da monitorare

conclusioni
Conclusioni
  • la determinazione genotipica delle resistenze permette di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai metodi tradizionali
  • i microarray sono attualmente l’unica tecnologia con potenzialità di monitorare l’intero spettro delle mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare
  • la sensibilità genotipica deve sempre essere confermata dal test fenotipico
    • false sensibilità: in caso di resistenze non associate a mutazioni note
    • false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti resistenti al disotto della soglia del 1%