Separation Techniques

1. Separation Techniques วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

2. ปฏิกิริยาวัดปริมาณสาร A สาร A + สาร B สาร C + สาร D 1 2 3 1 2 3 ปล่อยให้เกิดปฏิกิริยา Ablk Aunk Astd Reagent + DW Reagent + Sample Reagent + Standard วัดการดูดกลืนแสงสาร D โดยเทียบ Ablkเป็น 0 ความเข้มข้น = Cstd สารอื่นๆ ใน Sampleยกเว้นสาร A ถ้าทำปฏิกิริยากับสาร B หรือรบกวนการวัด(ค่าดูดกลืนแสง) เรียกว่า สารรบกวนการตรวจ วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

3. สารเคมีที่ต้องการตรวจวัดส่วนใหญ่อยู่ในส่วนที่เป็นสารเคมีที่ต้องการตรวจวัดส่วนใหญ่อยู่ในส่วนที่เป็น serum/plasma Serum หรือ Plasma centrifuge Clotted blood หรือ Packed blood Whole blood • Proteins • Fats • Carbohydrates • Minerals น้ำ และ สารเคมี cells ละลายน้ำได้ ละลายน้ำไม่ได้ วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

4. แนวทางการวิเคราะห์ปริมาณสารเคมีแนวทางการวิเคราะห์ปริมาณสารเคมี Sample แยกสารจาก ตัวอย่าง ทำปฏิกิริยา ที่จำเพาะกับสาร ทำให้แห้ง วัดการเกิดปฏิกิริยา ตรวจวัดสมบัติเฉพาะของสาร ชั่งน้ำหนัก • ค่าดูดกลืนแสง • การนำไฟฟ้า • การเปล่งแสงของสาร ปริมาณสาร วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

5. เทคนิคต่างๆ ในงานวิเคราะห์ การแยกสาร(separation)อาศัยความแตกต่างของ คุณสมบัติการละลาย ขนาดโมเลกุล ค่าประจุไฟฟ้า • Filtration • Dialysis • Gel filtration • chromatography • Precipitation • Extraction • Electrophoresis • Ion exchange • chromatography • Drying (Evaporation) and • Lyophilization วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

6. เทคนิคการแยกสาร Separation Techniques การตกตะกอน (Precipitation) การสกัด (Extraction) การกรอง (Filtration) การทำให้แห้ง (Evaporation) ไดอาไลซิส (Dialysis) โครมาโทกราฟี (Chromatography) อิเล็กโทรโฟเรซิส (Electrophoresis) ต้องการให้ น.ศ.เรียนรู้ กลไก/หลักการแยกสารและวัสดุอุปกรณ์ที่ใช้ ศึกษาเนื้อหาได้จาก หนังสือเคมีคลินิกพื้นฐาน หน้า 211-252 วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

7. Protein precipitation(การตกตะกอนโปรตีน) ทำให้โปรตีนไม่ละลาย Amino acids Peptide bond side chain ของกรดอะมิโน Peptide chain (Protein) โปรตีนประกอบด้วยกรดอะมิโน (amino acids) • ประจุของโปรตีนขึ้นกับชนิด side chain ของกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบของโปรตีน ประจุของโปรตีนขึ้นกับ pHและ R • โปรตีนที่แสดงประจุ จึงละลายน้ำได้ วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

8. การแสดงประจุของกรดอะมิโนขึ้นกับ pH และประจุของ R Low pH High pH Zwitter ion Isoelectric point(pI) : pH ที่โปรตีนมีประจุสุทธิเป็น ศูนย์ ณ pH = pI โปรตีนจะไม่ละลายน้ำ วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

9. ตัวอย่างกรดอะมิโนที่มี side chain ซึ่งแสดงประจุได้ แสดงประจุ + (รับ H+)เมื่อ pH เป็น acid Histidine Lysine Arginine แสดงประจุ – (ให้ H+) เมื่อ pH เป็น base Aspartate Glutamate วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

10. Heme group Primary structure Secondary structure Tertiary structure Quaternary structure http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/PRECIP/precpintro.html การละลายน้ำของโปรตีนขึ้นกับโครงสร้างโมเลกุล วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

11. กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ)กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ) http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/PRECIP/precpintro.html • ปัจจัยที่ทำให้โครงสร้างของโปรตีนเสียสภาพธรรมชาติ • ทำให้โปรตีนไม่ละลายน้ำ (ตกตะกอน) เช่น • ความร้อน (ทำลาย H-bond) วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

12. กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ)กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ) • Isoeletric Precipitation changing the pH of the protein solution • Use of an Organic Solvent for Precipitation น้ำ(H2O)ชอบจับกับ hydrophilic surfaces ของโปรตีน Organic solventชอบจับกับ hydrophobic surfaces ของโปรตีน Organic solvent ทำให้ dielectric constant of the medium ลดลง วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

13. S is the solubility of the protein in the organic solvent Sw is the solubility in water D is the dielectric constant of the medium when organic solvent is added Dw is the dielectric constant of the water R is the gas constant T is the absolute temperature A is a constant วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

14. กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ)กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ) • Salting out precipitation ใช้สารแย้งจับกับโมเลกุลของน้ำ ใช้เกลือที่ละลายน้ำได้ดี เช่น (NH4)2SO4 เรียกปรากฏการณ์ว่า salting out การละลายของโปรตีนต้องมีเกลือในความเข้มข้น ที่เหมาะสม เรียกปรากฏการณ์ว่า salting in (การละลายของโปรตีนแปรผันตรงกับความเข้มข้นของเกลือ ในน้ำ) ลำดับของอนุมูลลบที่ทำให้โปรตีนตกตะกอนได้ดี citrate > phosphate > sulphate > acetate chloride > nitrate > thiocyanate วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

15. กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ)กลไก/หลักการทำให้โปรตีนตกตะกอน(ไม่ละลายน้ำ) • Addition of a non-ionic polymer or metal ions dextrans and polyethylene glycols reduce the amount of water available to interact with the protein Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, and Cd2+ will bind strongly to carboxylic acids and to nitrogenous compounds Ca2+, Ba2+, Mg2+, and Pb2 will mainly bind to carboxylic acids Ag+, Hg2+, and Pb2+ will bind strongly to sulhydryl groups วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

16. Cation precipitation Somogyi method ใช้ Ba(OH)2 + ZnSO4 ทำให้สารละลาย มีสภาพ base โปรตีนแสดงประจุลบ Ba(OH)2 Ba2+ + 2 OH- ZnSO4 Zn2+ + SO42- เกาะกับประจุลบของโปรตีน Ba2+ + SO42- Ba SO4 เกลือไม่ละลายน้ำ Ba(OH)2และ ZnSO4ควรมีจำนวน mole เท่ากัน วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

17. Anion precipitation (Folin-Wu Method ) ใช้ Tungstic acid H2SO4 + Na2WO4H2WO4+ Na2SO4 2H+ WO42- 2Na+ SO42- ทำให้สารละลาย มีสภาวะ acidic โปรตีนแสดงประบวก เกาะกับประจุบวกของโปรตีน ตกตะกอน บิลิรูบินได้ดี วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

18. การสกัด (extraction) ใช้หลัก like dissolve like สารที่มีขั้วละลายได้ดีกับตัวทำละลายที่มีขั้ว และ สารที่ไม่มีขั้วละลายได้ดีกับตัวทำละลายที่ไม่มีขั้ว • สารที่ใช้สกัดต้องไม่ทำปฏิกิริยากับสารที่ต้องการสกัด • และแยกออกได้ง่าย • สารที่ใช้สกัดอาจเป็นสารชนิดเดียว หรือ • เป็นสารละลายผสมที่มีสภาพขั้วต่างกันและ • แยกออกจากกันได้ง่ายหลังการสกัด สารอินทรีย์ที่นิยมใช้เป็นสารสกัด ได้แก่ ethanol, ether, benzene, toluene, chloroform วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

19. การสกัดใช้แยกของเหลวออกจากของแข็ง หรือ ของเหลวออกจากของเหลวได้ อุปกรณ์ที่ใช้สำหรับการสกัด Separating funnel • ในระหว่างการสกัดควรระวัง • # การเกิด micro emulsion • # ความดันไอที่มากขึ้นภายในอุปกรณ์ที่ใช้ ซึ่งความดันไอ • ที่เพิ่มขึ้นเกดจาก • ไอระเหยของสารสกัดอินทรีย์ที่ใช้ • แก็สที่เกิดขึ้นจากการทำปฏิกิริยาเคมีระหว่างการสกัด วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

20. Soxhlet extraction ไอระเหยกลั่นตัวเป็นของเหลวลงมาซะล้างเอาสารที่ต้องการ http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/41/Soxhlet_Extractor.jpg http://web2.slc.qc.ca/jmc/www/Chemweb/oldchemweb/images%5Csoxhlet.jpg วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

21. การกรอง (filtration) แยกของเหลวออกจากของแข็ง โดยให้ให้ของเหลวไหล ผ่านตัว(แผ่น)กรอง(filter) เช่น กระดาษ ใยแก้ว เยื่อเมมเบรน (membrane) อุปกรณ์ช่วยในการกรอง ได้แก่ กรวยกรอง (funnel) วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

22. การพับกระดาษกรองแบบจีบการพับกระดาษกรองแบบจีบ http://chemsci.kku.ac.th/crystal/images/pic4.gif วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

23. Evaporation (การระเหย) ทำให้กลายเป็นไอระเหยตามจุดเดือดของสารและทำให้กลั่น ตัวกลับเป็นของเหลว วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

24. Lyophilizer or freezed dryer ทำให้สารละลายเป็นของแข็งโดยการแช่แข็ง แล้ว ดูดเอาน้ำออก(ระเหิด)เพื่อให้เหลือของแข็งที่แห้ง ใช้แยกโปรตีนออกจากสารละลาย Freeze dryer flask Freeze sample Refrigerator -70˚C High vacuum pump น้ำ(แข็ง)กลายเป็นน้ำ(ของเหลว)และพาไปที่ refrigerator เพื่อทำให้กลายเป็นน้ำแข็ง วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

25. Dialysis แยกอิออนออกจากสารละลายโปรตีน Dialysis membrane Concentrated solution Buffer At start of dialysis At equilibrium หลังการ dialysis สารละลายในถุง dialysis มีปริมาตรมากขึ้น วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

26. ปฏิบัติการเปรียบเทียบการตกตะกอนโปรตีนปฏิบัติการเปรียบเทียบการตกตะกอนโปรตีน ขั้นตอนการตกตะกอนโปรตีน วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

27. ขั้นตอนการวัดปริมาณโปรตีนขั้นตอนการวัดปริมาณโปรตีน วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

28. ปฏิกิริยาตรวจวัด Protein ด้วยวิธี Lowry Method พันธะเพปไทด์และกรดอะมิโนไทโรซีนและทริปโทเฟน ของโปรตีนจะจับกับCu2+ภายใต้สภาวะด่าง ได้ Cu-protein complex, copper tyrosine complex และtryptophane complex รีดิวซ์ phospho-tungstic acidและ phosphomolybdic acid ได้ tungsten blueและmolybdenum blue ซึ่งมีสีฟ้าวัดการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 650 นาโนเมตร วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

29. โครมาโทกราฟี (chromatography) Mobile phase Stationary phase แยกสารโดย สารตัวพาเคลื่อนที่(mobile phase) พาสารให้ เคลื่อนที่ได้ต่างกันบนตัวกลางที่อยู่กันที่(stationary phase) Planar chromatography Column chromatography ทิศทางการเคลื่อนที่ของ mobile phase วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

30. จำแนกตามกลไกการแยก • Adsorption chromatography • Partition chromatography • Ion exchange chromatography • Gel filtration chromatography • Affinity chromatography วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

31. Adsorption chromatography Solute1 Solute2 ทิศทางการเคลื่อนที่ของ mobile phase Mobile phase Stationary phase มักมีสภาพขั้ว stationary phase ดูดซับกับ solute1 และ solute2 ได้ต่างกัน วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

32. Thin layer chromatography a c b c a c b Start point Retardation factor (RF) สารชนิดเดียวกันมีค่า RF เท่ากัน RF = RF = วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

33. Partition chromatography เช่น paper chromatography วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

34. สารมาตรฐาน sample วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

35. Gel filtration chromatography or Molecular Exclusion Chromatography วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

36. http://www.hmds.org.uk/figures/fitc_sep.jpg http://genchem.chem.wisc.edu/demonstrations/Images/23biochem/sizeexclusion.jpg วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

37. เก็บสารละลายที่ไหลออกจากเก็บสารละลายที่ไหลออกจาก Column chromatography โดยขยับหลอดที่เก็บตามเวลา ที่ตั้งไว้ (คงที่ทุกหลอด) อัตราการไหลลงที่ ทุกหลอดจะ มีปริมาตรเท่ากัน Fraction collector วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

38. สารที่ใช้เป็นตัวชี้วัดการเคลื่อนที่ใน column Blue dextranจะไหลออกมาก่อน ปริมาตรที่ blue dextran ออกมา เรียก void volume (Vo) DNP lysineจะไหลออกมาช้าที่สุด ปริมาตรที่ DNP lysine ออกมา เรียก total volume (Vt) ปริมาตรที่ สารต้องการแยกออกมา เรียก elution volume (Ve) วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

39. Relative migration (K) Log Mr Relative migration วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

40. Ion exchange chromatography Matrix Ion exchanger • Anion-exchanger • มีประจุลบ • Cation-exchanger • มีประจุบวก วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

41. Affinity Chromatography วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

42. Gas liquid chromatography วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

43. Chromatogram วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

44. การแยกสารด้วยสนามไฟฟ้าการแยกสารด้วยสนามไฟฟ้า Electrophoresis + - ตัวกลางค้ำจุน อิออนของ buffer อัตราการเคลื่อนที่ของสาร Q ประจุสิทธิของสาร K ค่าคงที่ R รัศมีของโมเลกุลสาร ความหนืดของสาร วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

45. วัสดุอุปกรณ์สำหรับ electrophoresis • Power supplyควบคุมแรงดันหรือกระแสไฟฟ้ากระแส • ตรงให้คงที่ ในระหว่างการแยกสาร • Electrophoresis chamberรองรับ buffer และ • support media • Support mediaเช่น กระดาษ, cellulose acetate • starch gel, agarose gel, polyacylamide gel • Bufferควบคุมค่า pH ในระหว่างแยกสาร เพื่อรักษา • สภาพประจุของสารไว้ • Staining dye ใช้ย้อมสีเพื่อให้เห็นตำแหน่งของสาร • หลังการแยก เช่น Coomassie brilliant blue R-250 • ย้อมสีโปรตีน วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

46. Type of electrophoresis แบ่งตามชนิดของตัวกลางค้ำจุน Paper electrophoresis Cellulose electrophoresis Starch gel electrophoresis Agarose gel electrophoresis Polyacrylamide gel electrophoresis Polyacylamide gel เกิดจากการ cross-link ของ acrylamide กับ methylene-bis acrylamide โดยมี ammonium persulfate เป็น ตัวเร่ง และ TEMED เป็นตัวทำให้เกิดอนุมูลอิสระเพื่อเริ่มต้นปฏิกิริยา cross-link วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

47. http://www.funsci.com/fun3_en/exper1/exper1_21.gif วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

48. วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

49. http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/protein/electrophoresis.jpghttp://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/protein/electrophoresis.jpg วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.

50. ใช้ Desitometer scan วัดความหนาแน่นของสีที่ย้อมติด กับ protein วิสุทธิ์ กังวานตระกูล กลุ่มวิชาเคมีคลินิก สายวิชาเทคนิคการแพทย์ ม.ข.