slide1
Download
Skip this Video
Download Presentation
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 28

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod. - PowerPoint PPT Presentation


  • 107 Views
  • Uploaded on

Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod. Petr Koutecký & Jiří Košnar, 201 3. Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364. RAPD – princip.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin 10 . RAPD, ISSR apod.' - lerato


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1
Metody molekulární biologie v ekologii a systematice rostlin

10. RAPD, ISSR apod.

Petr Koutecký & Jiří Košnar, 2013

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU

reg. č. CZ.1.07/2.2.00/15.0364

rapd princip
RAPD – princip
  • Random amplified polymorphic DNA (Williams et al. 1990)
  • Hledáme polymorfismus DNA pomocí PCR reakce s1 arbitrárním primerem
  • Sekvenci primeru volíme „náhodně“:
    • obvykle dekanukleotid
    • počet různých dekanukleotidů: 410 = 1048576
    • volí se primery se zvýšeným (60-70%) obsahem GC → stabilnější vazba při PCR (annealing, extenze při 72°C)
  • V praxi se sekvence primerů „naslepo“ zkouší:
    • test většího počtu primerů
    • výběr těch, které dávají vhodné banding pattern (dost variability a zároveň jednoznačné vyhodnocení výsledků)
rapd princip1
nic

(orientace)

nic

(moc daleko)

RAPD – princip
  • PCR reakce proběhne, pokud:
    • jsou přítomny komplementární sekvence k primerům na protilehlých vláknech DNA
    • jsou dostatečně blízko u sebe
  • separace fragmentů elektroforézou na základě délky
  • jsou vzorce na výpočet očekávaného počtu proužků (např. Williams et al. 1993), ale nefungují
rapd gel
http://pgrc3.agr.ca/RAPD gel
  • agarosa (horizontální) nebo polyakrylamid (vertikální)
  • barvení EtBr, SYBR green, GelRed apod.
    • ideálně po proběhnutí ELFO, post-staining (minimalizace deformací a posunů proužků)
  • vyhodnocení: přítomnost / nepřítomnost proužku
    • dominantní data (0 / 1)
rapd vznik varibility
kodominantníRAPD – vznik varibility
  • Mutace v místě nasedání primerů (zánik / vznik místa)

většinou detekovatelný jen kratší produkt

  • Inzerce / delece v amplifikovaném úseku
  • Inverze apod.
rapd metodick probl my
RAPD – metodické problémy
  • Metoda velmi citlivá na reakční podmínky PCR
    • koncentrace a čistota DNA
    • koncentrace primerů, Mg2+, polymerasy, složení pufru,…
    • konkrétní průběh teploty (rychlost zahřívání,…) → nutno používat stejný cykler
  • Relativně nízká teplota annealingu (35-45°C)
    • mismatched priming = amplifikace i z míst, kde primery nesedají zcela přesně (mírně odlišná sekvence)
    • zásadních ± 8 nukleotidů na (3’ konci), zbytek nemusí nasedat přesně
    • zejména u kratších fragmentů mohou vznikat stabilní smyčky z daného vlákna DNA (konce mají komplementární sekvenci!) → horší amplifikace
rapd metodick probl my1
RAPD – metodické problémy
  • Neznámá genetická podstata proužků
    • nejistá homologie
    • dominance (nepoznáme heterozygoty), ale ne vždy
      • až 5% kodominatních proužků (Williams et al. 1990)
    • neznámá dědičnost (nukleární vs. organelové)
      • biperentální vs. uniparentální
    • kompetice primerů apod.
      • ve směsi DNA dvou různých organismů se neamplifikují proužky z obou stejně (pokud se mírně liší sekvence v místech nasedání primeru)
      • mohou vznikat heteroduplexy (2 různě dlouhá vlákna) → jiná mobilita při elfo
      • může nastat v genomu hybridů, allopolyploidů,…
    • nespecifičnost – amplifikuje jakoukoliv DNA
      • endofytické houby, epifytické řasy,…
rapd standardizace
RAPD - standardizace
  • vyhodnocujeme jako dominantní data (0 / 1)
  • intenzita proužků se neuvažuje
    • mohou být heterozygoti, ale nemusí
  • obecně slabé produkty se neuvažují
    • raději méně spolehlivých znaků nežvíce, ale nespolehlivých
  • krátké fragmenty (< 100 bp) se většinou neuvažují
    • zvyšuje se nejistota homologie
  • podobně i u příliš dlouhých fragmentů
    • 1700 bp je na agarose téměř nerozlišitelné od 2000 bp
  • všechny analýzy provádět stejně a na stejném cykleru
  • všechny vzorky 2× (včetně extrakce!)
    • uvažují se jen pozice, kde jsou opakování shodná
rapd srovn n s jin mi metodami
Výhody

není nutná znalost genomu (univerzální metoda)

relativně málo DNA

jednoduchost a rychlost

cena

fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu

velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

RAPD – srovnání s jinými metodami

Nevýhody

  • citlivost na reakční podmínky, nesrovnatelnost mezi laboratořemi → někteří recenzenti zamítají publikace založené na RAPD...
  • dominantní data
  • nejistá homologie fragmentů atd.
  • neznámá dědičnost fragmentů
slide10
nic

(orientace)

nic

(moc daleko)

flanking sequence

CACACACACACACACACA

flanking sequence

ISSR
  • Inter-simple sequnce repeats (Zietkiewicz 1994)
  • podobný princip jako RAPD
  • jako primery slouží mikrosatelitové sekvence
    • mikrosatelit (= simple sequence repeat, SSR) je jeden z typů repetitivních sekvencí - několikanásobné opakování krátkého (2-6 bp) sekvenčního motivu za sebou
  • amplifikují se úseky mezi dvěma mikrosatelity stejné sekvence a opačné orientace
slide11
ISSR
  • menší citlivost na reakční podmínky než RAPD
  • primery delší (cca 18-20 bazí) než u RAPD
    • vyšší teplota annealingu (~45-60°C) → přesnější amplifikace (menší intenzita mismatched priming)
  • primery zahrnující několik bazí flanking sequence = anchored(„ukotvené“, např. GAGAGAGAGAGAGAGAYC) vs. unanchored (GAGAGAGAGAGAGAGA)
    • anchored primers neamplifikují vždy („selektivní báze“)
  • někdy používán touch-down postup
    • vyšší teplota annealingu v prvních cyklech PCR → specifičtější amplifikace, i když menší výtěžek
    • v dalších cyklech nižší teplota → vyšší výtěžek, specifita zajištěna předešlými cykly
issr gely
ISSR - gely
  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza:
    • dlouhé gely (aspoň ~40x40 cm); agarosa 1-1.5% w/v, 80V přes noc
    • post-staining
issr gely1
ISSR - gely
  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

KOR

KAR

BAL

KEP

SAF

RYL

SKA

SKR

49 T

47

48

25

26

50

52 T

53 T

111

113 T

114 T

123

124

125

131

132

159

160

164

12

13

24

11

112

Carex, Jan Košnar

1st run

issr gely2
ISSR - gely
  • separace fragmentů na gelu (agarosa n. polyakrylamid); finální analýza: všechny vzorky 2x

KOR

KAR

BAL

KEP

SAF

RYL

SKA

SKR

49 T

47

48

12

13

24

25

26

50

52 T

53 T

111

113 T

114 T

123

124

125

131

132

159

160

164

11

112

Carex, Jan Košnar

2nd run

issr fragmenta n anal za
ISSR – fragmentační analýza
  • separace fragmentů v sekvenátoru → fragmentační analýza
  • fluorescenčně značené primery
    • pozn.: optimalizace – značený a neznačený primer stejné sekvence se může lišit v požadavcích na jednotlivé parametry PCR
  • separace fragmentů kapilární elekroforézou v sekvenátoru
    • vzorky nemigrují v čase lineárně, proto přidáván velikostní standard (směs fragmentů DNA o známé délce)
    • možnost kombinovat několik primerů značených různou barvou
    • v naší laboratoři až 4 barvy (6FAM, VIC, NED, PET) + 5 barva size standard (LIZ)
issr fragmenta n anal za1
ISSR – fragmentační analýza

Centaurea, J. Karásek & P. Koutecký

issr srovn n s jin mi metodami
ISSR – srovnání s jinými metodami
  • jako RAPD, ale spolehlivější, méně citlivé na reakční podmínky

Výhody

  • není nutná znalost genomu (univerzální metoda)
  • relativně málo DNA
  • jednoduchost a rychlost
  • cena
  • fragmenty (teoreticky) rozmístěny po celém genomu
  • velké množství (~ desítky až stovky) polymorfních fr.

Nevýhody

  • dominantní data
  • nejistá homologie a neznámá dědičnost fragmentů
  • somatické mutace (nadhodnocují diverzitu)
  • do jisté míry citlivost na reakční podmínky, nepřenositelnost pro jiné studie, nutnost optimalizace primerů
dal podobn metody
Další podobné metody
  • DNA amplification fingerprinting (DAF)
    • velmi krátké primery (5 nukleotidů)
    • různé teploty annealingu (vysoké i nízké)
  • Arbitrarily primed PCR (AP-PCR)
    • delší primery (≥ 20 nukleotidů)
    • na začátku několik cyklů s nízkou t annealingu (mismatch), následně cykly s vysokou t annealingu (přesná amplifikace)
  • Sequence-characterised amplified regions (SCAR)
    • osekvenování vybraných RAPD proužků (vyříznutí, klonování)
    • specifické primery (≥ 20 nukleotidů) komplementární ke koncům
    • primery jsou specifické pro daný lokus – lze rozlišit i kodominantní varianty
    • delší primery = vysoká reprodukovatelnost
dal podobn metody1
Další podobné metody
  • random amplified microsatellite polymorphism (RAMP)
    • kombinace 5‘-anchored ISSR primeru a RAPD primeru
    • složité PCR cykly (primery mají různé teploty annealingu –střídání v různých cyklech)
    • ISSR primer značený (fluorescenčně n. radioaktivně) → produkty amplifikované obou stran RAPD primerem nejsou vidět
  • … a mnoho dalších metod využívajících jako primery:
    • specifické sekvence různých typů transpozonů
    • kombinace retrotranspozonů a mikrosatelitů
    • kombinace s restrikčním štěpením fragmentů
issr aplikace
ISSR - aplikace
  • populační genetika (diverzita, fragmentace,…)
    • ochranářská
    • invazní
  • klonální a prostorová struktura populací
  • hybridizace
  • rozmnožovací systémy
  • taxonomie (vymezení a podobnost taxonů,…)
  • (fylogeografie)
  • (mezidruhové vztahy, fylogeneze)
popula n a ochran sk genetika
www.primulaworld.comPopulační a ochranářská genetika

Crema et al. 2009, Plant Syst. Evol. 280: 29–36

  • Primula apennina, endemit
  • 6 populací „v řadě“, 9 primerů / 164 lokusů
  • relativně velká variabilita – He,, Shanon. index(sexuál, hetorostylie, daleko létající opylovač)
  • souvislost s pozicí populací (nejmíň na kraji,nejvíce v prostřední populaci)
  • tři genetické skupiny (BAPS), zřetelný tok mezi populacemi
  • potvrzeno i Mante-lovým testem(mírná pozitivní korelace)
taxonomie
Taxonomie

Jiménez et al. 2009, Folia Geobot. 44: 145-158

  • Narcissus sect. Pseudonarcissi, Španělsko
  • spousta „podezřelých“ endemických druhů
  • 6 primerů – 89 lokusů + ITS sekvence
  • PCoA, NJ strom, (+ parsimonie pro ITS)
  • 3 výrazné skupiny v PCoA
  • nesoulad s morfologií
  • některé druhy nelze rozlišit
  • podpořeno také ITS
  • návrh revize taxonomie (spojení některých druhů)
hybridizace
Hybridizace

Ducarme et al. 2010, Folia Geobot. 45: 387-405

  • Rhinanthus minor, R. angustifolius
  • test 100 RAPD a 100 ISSR primerů, výběr 8 druhově specifických lokusů (4 pro každý druh)
  • hybridní index: čisté druhy -4 a 4, F1 hybrid má 0, zpětní kříženci něco mezi
  • 2 přírodní populace + 1 umělá
  • vznik hybridů v umělé populaci
  • většina zpětných kříženců k Rh. angustifoliusvysvětlováno chováním opylovačů a většíautogamie u Rh. minor
  • drobné meziroční fluktuace
hybridizace1
Hybridizace

Lo 2010, J. Evol. Biol. 23: 2249–2261

  • mangrove rodu Rhizophora, 3 základní druhy a 3 předpokládaní hybridi (morfologie, neklíčivost semen)
  • 12 ISSR primerů (+ITS, cpDNA)
  • privátní alely zákl. druhů; hybridi 0, ale celkově víc alel (součet rodičů)
  • STRUCTURE identifikuje vždyhybrida (směs)i jeho rodiče
  • NewHybrids: všechno F1 hybridi
  • každá lokalita svůj ISSR genotyp →opakovaný vznik hybridů
  • ITS, cpDNA: ukazuje naobousměrnou hybridizaci

jedna z lokalit, 3 druhy + hybrid

rozmno ovac syst my
Rozmnožovací systémy

Han et al. 2009, Plant Syst. Evol. 277: 13–20

  • Lotos nucifera v Číně
  • sběr semen (9-20) z 20 rostlin

+ dospělé rostliny, 10 populací

  • 5 / 12 primerů (28 / 173 lokusů)
  • porovnání potomstva a mateřský r.v programu MLTR
  • velká míra cizoprášení (>90%)
  • skoro žádný inbreeding (f ~ 0)
  • mírná autokorelace (podobné zdroje pylu u blízkých mateřských rostlin)

+ obvyklá studie populací (AMOVA, Mantel test,…)

identifikace klon
Identifikace klonů

Gross et al. 2012, Ann. Bot. 109: 331–342

  • Klonální struktura sterilních i fertilních popu-lací Greivillea rhizomatosa (Proteaceae)
  • Simpsonův index, gene diversity, modelypříbuznosti jedinců
  • 4 ISSR primery / 120 lokusů
  • velká klonální diverzita (>90%) i u sterilních populací (→ minulost)
  • somatické mutace ! 10 ze 42 ramet spojených pod zemí mělojiný genotyp
  • podle modelů 17-48% genotypů(v různých populacích) mohlo vzniknout somat. mutacemi

[pozor, jiný druh]

prostorov z visloti n co jako fylogeografie
Prostorové závisloti (něco jako fylogeografie)

Belluci et al. 2011, Plant Biol. 13: 381-390

  • Tripodion tetraphyllum (= Anthyllistetraphylla) v sev. Africe
  • sucho, včetně intenzivních pastvin
  • 36 lokalit Maroko-Tunisko, z každésemena, z nich ale jen 2-3 kytky (celk. 94)
  • 5 ISSR primerů / 32 lokusů (+ cpSSR + 1 morfol. znak)
  • zřetelně klesající variabilita od západu k východu
  • 2 extrémní genotypy (STRUCTURE) na okrajích gradientu západ-východ, plynulý přechod (klinální variabilita)
  • relativně velké rozdíly mezi „populacemi“ (autogamie)
  • zřetelné autokorelace na škále <400 km
  • asi migrace od záp. k východu a selekce ve prospěch určitého genotypu na V okraji gradientu
prostorov struktura populace
Prostorová struktura populace

Matesanz et al. 2011, J. Ecol . 99: 838-848

  • společná populace Thymus vulgaris (hojný)+ Th. loscosii (endemit) na ploše 10 m2
  • prostorové rozmístění jedinců v 1m2 plochách + faktory prostředí (vlhkost, půda, pokryvnost,…)
  • genetická variabilita (5 ISSR primerů pro druh)
  • obecně shlukovité rozmístění obou druhů a negativní vztah mezi nimi
  • u Th. vulgaris žádné klony, u Th. loscosii79 genotypů ze 100)
  • korelace mezi genetickou podobností Th. loscosii a abundancí Th. vulgaris – asi selekce genotypů Th. loscosii specializova-ných na určitou míru kompetice Th. vulgaris
ad