Introduction

1. Introduction Pr Eric Chabriere

2. Nous sommes à l’ère post génomique Une macromolécule c’est: Une séquence, une structure (dynamique), une (des) fonction(s) beaucoup de séquences, peu de fonction

3. La connaissance de la structure 3D est révolutionnaire pour l’étude du vivant C’est souvent une interprétation directe • La structure: • -Informations précise sur le repliement • -détermination des interactions • protéine-protéine, protéines-substrat, protéines-cofacteur,… • -Mécanisme catalytique, reconnaissance moléculaire • Révèle les liens fonctionnels et évolutifs • Base pour les biotechnologies • Inhibiteurs, médicaments, mutants • Il faut intégrer les informations structurale avec les informations de génétiques, biochimie, biologie cellulaire, biologie moléculaire, bioinformatique… La biologie structurale : le microscope moderne

4. Les échantillons biologiques sont de taille variée

5. Principe : Soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions Système à étudier e.g. solution aqueuse, cristal Signaux ‘émis’ par le système sous l’effet de la ‘sonde’ e.g. Transmission Diffusion à ‘grands’ angles ‘Sonde’ e.g. faisceau de lumière Rayons IR : Spectro Infra rouge Champ radiofréquence + champ magnétique : RMN Ionisation + champs E et B : spectro de masse Rayons X : diffraction X Neutrons, électrons Contiennent de l’information sur les caractéristiques du système

6. La biologie structurale est un processus complexe et interdisciplinaire

7. Les différentes techniques Radiocristallographie principe: interaction RX matière Avantages: positions précises des atomes, pas de limite de taille (ex ribosome). Inconvénients: cristal, problème de la phase, atomes d’hydrogène difficiles à voir RMN principe: Interaction des spins des noyaux dans un champs magnétique. Information sur l’environnement de chaque noyau. Avantages: En solution, Information sur la dynamique de la macromolécule. Inconvénients: Limitation de taille (30kDa avec marquage), moins précis que la cristallographie, solution concentrée Microscopie électronique principe: interaction électron matière Avantages: Pas de problème de phases (lentille) pas de limite de taille (ex virus). structure globale Inconvénients: basse résolution, dommage sur l’échantillon PFOR (2PDA) Prion humain (1HJN) Virus coxsachie Cav21

8. Diffusion des rayon X : Small Angle X-ray Scattering (SAXS) principe: interaction RX matière Avantages: échantillon en solution, pas de cristal Inconvénients: basse résolution Neutrons (complément à la radiocristallographie) principe: interaction neutrons matière Avantages: les atomes d’hydrogène sont visibles Inconvénients: Gros cristaux Bioinformatique (en très fort progrès) Principe: modélisation in silico, Avantages: peu cher, rapide inconvénients: précision, qualité des résultats Chimie-physique principe: marquage, spectroscopie, biochimie, … Avantage: Informations Inconvénients: Mesure indirect, interprétation the modular cellulase Cel48F from Clostridium cellulolyticum Dichroïsme circulaire Aucune technique n’est complète tout est bon à prendre

9. Ere de la génomique structurale

10. Comparaison des structures déposées (PDB) avec les différentes techniques La cristallographie est le méthode la plus utilisée

11. La cristallographie une discipline récente Prix Nobel de physique 1901 Wilhelm Conrad Röntgen Découverte des rayons X 1914 Max von Laue Méthode de détermination des structures cristallines grâce à la diffraction des rayons X 1915 Henri et Lawrence Bragg Fondements de la radiocristallographie moderne 1927 Arthur Holly Compton et Charles Thomson Rees Wilson Découverte de l’effet Compton : diffusion des rayons X. 1937 Clinton Joseph Davisson et Sir George Paget Thomson Confirmation de la théorie ondulatoire de Louis de Broglie par diffraction sur un cristal. 1994 Bertram N. Brockhouse et Clifford G. Shull Etude de la structure et des propriétés des cristaux (diffraction de neutron)

12. Prix Nobel de chimie et médecine • 1946 James Batcheller Sumner • découverte de la cristallisation des enzymes • 1957 Lord Alexander R. Todd • travaux sur les nucléotides et les coenzymes nucléotidiques • 1958 Frederick Sanger (2 prix + séquençage ADN) • la structure des protéines, spécialement celle de l'insuline • 1962 Max Ferdinand Perutz et John Cowdery Kendrew • structure des protéines globulaires (hémoglobine et myoglobine) • F.Crick et J.D.Watson M.Wilkins, R. Franklin • structure de l’ADN • 1964 Dorothy Crowfoot Hodgkin • a détermination par les techniques des rayons X de la structure d'importantes substances biologiques (cholesterol, vitamine B12, …) • 1972 William H. Stein • relation structure fonction de la ribonuléase • 1982 Aaron Klug • microscopie électronique cristallographique • structure des complexes acides-nucléiques protéines biologiquement importants • 1985 Herbert A. Hauptman et Jerome Karle • mise au point de méthodes directes de détermination des structures cristallines • 1988 Johann Deisenhofer, Robert Huber et Hartmut Michel • détermination de la structure tridimensionnelle d'un site de la réaction photosynthétique • 2003 Roderick MacKinnon • structure de canaux ioniques (en particulier un canal potassium) • 2006 Roger Kornberg • pour ses travaux sur les bases moléculaires de la transcription chez les eucaryotes (ARN polymérase II) De nombreux autres en biologie structurale. RMN, spectrométrie de masse,…

13. Autres étapes importante en biologie structurale 1978-1980 M Rossman et S. Harrisson Première structures de virus 2000-2001 Structure des ribosomes 30S, 50S,70S

14. Etapes en biocristallographie Gène d’intérêt Expression purification cristallisation diffraction Echantillon biologique Structure de complexes phasage Interprétation biologique Biologie moléculaire modélisation Bioinformatique Autres informations Biotechnologies 2 étapes limitantes: cristallisation et phasage

15. Cout d’une structure

16. La purification. Pour cristalliser, l’échantillon doit être le plus pur possible (>98%). Il en faut une quantité importante de protéine 5-10mg (concentration 5-20mg) Vérifier systématiquement la qualité du lot: Gel SDS, coloration argentique activité

17. La cristallisation Obtenir un maximum d’information sur la stabilité de l’échantillons. Connaître les conditions de cristallisations de protéine voisine Plusieurs techniques. -Goutte suspendue -Goutte assise -batch Il existe des robots de cristallisation Génomique structurale

18. La diffraction Rayons X Neutrons Transformée de Fourrier Il faut que les cristal diffracte bien (résolution + monocristal)

19. A Grenoble Anode tournante (laboratoire) Synchrotron ESRF Réacteur à neutrons ILL Les synchrotrons dans le monde

20. Le phasage Pas de lentille de qualité pour les rayons X. Plusieurs techniques remplacement moléculaire on utilise les phase du modèle d’une protéine similaire (id seq >30%) dérivé d’atome lourds (MIR) On fixe des atome lourds sur la protéine (Hg, U, Tb, …) diffusion anomale (synchrotron) on utilise le propriété de diffusion anomale des atomes lourds (>Fe) Soit naturelle (ex agrégats 4Fe-4S) Soit fixé (Mir) Soit acide aminé modifié (ex Selenomethionine). (expression) Méthodes Directes Si reolution atomique (< 1,2Å)et petite protéine (<10Kda)

21. Modélisation Rayons X Neutrons Transformée de Fourrier En calculant la transformée de Fourier inverse on obtient la densité électronique de la molécule On place les atomes dans la densité électronique Il faut connaître la séquence

22. d = 4 Å Notion de résolution Plus la résolution est faible plus on pourra voir des détails fin Difficile de construire le modèle

23. d = 3 Å On commence a reconnaitre les acides aminé

24. d = 2 Å A cette résolution on peut voire les molécule d’eau

25. d = 1 Å Résolution atomique On voit chaque atome séparément

26. La structure

27. Le fichier PDB: les coordonnées de chaque atomes N° atome -- type d'atome– résidu–chaine--N° séquence—X- Y- Z—occupation—Facteur B Facteur d’agitation thermique (facteur B) Entre 2 et 60 Å2 Plus il est élevé, plus l’atome est agitée

28. Coloration en fonction du facteur B On voit les zones agité (attention petite vibration)

29. Interprétation Biologique Structure + complexe Mécanisme catalytique

30. RMN: résonance magnétique nucleaire. Le noyau de certains atomes possède un spin. 1H, 13C, 15N, 31P. B Le spin (aimant s'oriente dans un champs magnétique) Si on applique la bonne fréquence électromagnétique radiofréquence aux spin alignés (adapté en fonction du champs magnétique et de la nature de l'atome). Il y a résonance: les spins basculent. Il sont dans un état excité B Pour revenir à l'état stable, le spin va précesser (ex toupie) La vitesse de précession est dépendante de l'environnent chimique Cette vitesse de précession nous renseigne. Sur les liaisons, la proximité spatiale, la géométrie … Sur la structure

31. Appareille de RMN. Doit générer un champs magnétique très intense (10-15 T) Champs magnétique terrestre (47mT) L'échantillon doit être pur, concentré, soluble, stable (collecte plusieurs jours). La macromolécule ne peut être trop grosse (max 30Kda, avec marquage isotopique)

32. Spectre 1D. A chaque pic correspond un proton Spectre 2D. Couplage scalaire, dipolaire. Attribution + géométrie. Plusieurs spectres sont nécessaires

33. En RMN, on obtient une série de modèles

34. RMN. Protons (ou N15). petit échantillon 10-20 kDa petits oligonucléotides mesure des complexes. Dynamique des protéines

35. Microscopie électronique:

36. Les électrons sont des ondes (dualité onde particule) h constante de Planck : 6.626 10-34 Js l= h/mv Les lentilles sont des bobines magnétiques Les électrons interagissent avec le potentiel électrostatique Pb: contraste peu important, le flux d'électron détruit l'échantillon. On voit la projection du potentiel électrostatique

37. Coloration négative Sur une coupe mince de l'échantillon (dizaine nm), on rajoute un solution contenant des atomes lourds (tetraoxyde d'osmium ou de l'acétate d'uranyl). Ces atomes qui absorbent beaucoup les électrons vont se déposé en dehors de la macromolecules. Aini, la macromolécule apparaitra plus clair que ce qui l'entoure. (contraste négatif)

38. Cryo EM. L'échantillon est rapidement congelé dans la glace vitreuse Faible contraste L'échantillon est aléatoirement orienté Reconstruction 3D Resolution environ 10A

39. On place les modèles X-ray et RMN dans l'enveloppe obtenue par microscopie électronique

40. RX. On voit les électrons. Structure précise Il faut des cristaux RMN On voit les spins. Inadaptée au grosse macromolécule Microscopie électronique Projection du potentiel électrique Faible résolution (10Å) Reconstruction 3D, fastidieuse. Adapté à à les résolution de très gros complexe Combinaison avec structure RX et RMN