利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成

1. 利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成利用脂解酵素進行三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成 吳沛玲 張春生 南台科技大學 生物科技研究所 (NSC 92-2214-E218-002) 4.3 最適反應溫度 在開放系統下進行酯化反應，結果如圖二所示。當溫度從60 ℃升到65 ℃時，三苯基丁酸甘油酯轉化率會隨溫度而提升，但當溫度到達70 ℃以上，三苯基丁酸甘油酯轉化率則快速下降。可能是70 ℃的反應溫度會造成酵素失活，其可能原因有一、酯化反應之副產物水在70 ℃下使酵素失活；其二則是在較高溫度下，由於無溶劑之甘油系統黏度較高，無法使水分快速移除，造成局部水分太高導致逆反應之水解發生，才會造成轉化率無法提升。因此開放系統下反應溫度為65 ℃時最有利酯化反應的進行，此時三苯基丁酸甘油酯轉化率可達68 ％。 4.4 基質間比例 結果如圖三所示，當甘油與苯基丁酸之莫耳比為1 / 3時，其酯化程度最佳，甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之轉化率可達88 %。若將苯基丁酸的量增加到1 / 4、 1 / 5、1 / 6時，理論上甘油酯化率應會升高，但實際結果甘油酯化率反而下降，其可能原因來自不同醇酸比例改變了溶液之親疏水性，而造成平衡位置改變，實際原因需進一步探討，因此在開放系統下，保持甘油與苯基丁酸的莫耳比為1 / 3可得最佳甘油酯化率。 4.5 真空度 結果如圖四所示，當真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘油酯轉化率則愈高，顯示真空度之提高，可有效移除多餘的副產物水分，使得三苯基丁酸甘油酯轉化率提升。若將真空度降至1 torr時，三苯基丁酸甘油酯轉化率可高達93 %。 1.摘要 經酵素篩選，利用Candida antarctica之固定化脂解酵素催化可合成三苯基丁酸甘油酯(glyceryl triphenylbutyrate)前驅藥。比較有機溶劑與無溶劑系統，在無溶劑系統下可得到較高的轉化率，並有利於後段產物分離純化。在開放環境下有利酯化反應之副產物水分移除，且最適反應溫度為65 ℃。當甘油與苯基丁酸之莫耳比為1 / 3時，其酯化程度最佳，甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之轉化率可達88 %。若在反應過程中進行抽真空，可更有利水分迅速移除，真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘油酯轉化率則愈高，當將真空度降至1 torr時，三苯基丁酸甘油酯轉化率可高達93 %。 圖一. 選用八種不同菌種來源之酵素，其中Novo 435 lipase與lipase QLG屬固定化酵素，另外自製lipase CC、MY冷凍乾燥之固定化酵素，在開放的無溶劑反應系統中進行酯化反應。甘油1 mmole，苯基丁酸3 mmole，酵素量 0.05 g，反應溫度為60 ℃，常壓，反應時間為144小時。 2. 前言 芳香族脂肪酸之苯基乙酯(phenylacetate)與苯基丁酯(phenylbutyrate)可治療尿素循環失調 、腫瘤與癌症 、血紅素病 及 預防老化。此種藥物療效取決於在體內是否能長期維持在藥物之最低有效濃度，但此類藥物代謝很快。以三酸甘油酯方式進行投藥可延長體內藥物之半生期，能提高體內有效藥物濃度，可減少投藥劑量，且甘油本身即為生物體代謝之正常產物。文獻中指出三酸甘油酯若用化學法合成產率偏低且純化較複雜，而以脂解酵素催化進行合成，則可克服化學法的問題[1]，此外酵素在無溶劑系統下進行催化，不僅可以避免溶劑的毒性問題，且可減少純化的步驟[2]。由於1莫耳酸酯化會產生1莫耳的水，為了有利反應進行避免水解產生，可以藉由開放系統或抽真空的方式將水分移除[3]。芳香族脂肪酸如苯基乙酸、苯基丁酸之三酸甘油酯，由Brusilow於2000年獲得已三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥用於治療上述提過疾病之美國專利[4]，經進一步文獻及專利資料庫調查發現並無相關此類前驅藥物之製程研究，因此本計畫將利用酵素催化酯化反應開發三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成製程，如Scheme 1。 圖二. 開放系統下，反應溫度對三苯基丁酸甘油酯轉化率之影響。甘油5 mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，常壓，反應溫度分別為60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃。 5. 結論 利用脂解酵素催化酯化反應開發三芳香族脂肪酸甘油酯前驅藥合成，將得到以下幾點結論： 1. 酵素篩選：選用Novo 435 lipase (from Candida antarctita)來當做酯化反應之催化劑。 2. 反應系統：選擇無溶劑系統作為本實驗之適當反應系統，且能有利於後段產物分離純化。 3. 反應溫度：65 ℃時最有利酯化反應的進行。 4. 基質間比例：甘油與苯基丁酸之莫耳比為1 / 3時，其酯化程度最佳，甘油被酯化成苯基丁酸甘油酯之轉化率可達88 %。 5. 真空度：真空度壓力愈小，所得的三苯基丁酸甘油酯轉化率愈高，當將真空度降至1 torr時，三苯基丁酸甘油酯轉化率可高達93 %。 3. 研究方法 基質甘油(glycerol)與苯基丁酸(4-phenylbutyric acid)先加熱至60 ℃使其溶解，之後加入Novo 435之固定化脂解酵素進行酯化反應之催化，產物包含單苯基丁酸甘油酯(glyceryl monophenylbutyrate)、雙苯基丁酸甘油酯(glyceryl diphenylbutyrate)、三苯基丁酸甘油酯(glyceryl triphenylbutyrate)，及水分。 HPLC分析管柱使用RP-8 column；UV波長為216 nm；內標物為2-Nitrotoluene；流動相A為acetonitrile：H2O ( 0.01% trifluoroacetic acid ) ＝ 65：35 ( v/v )；流動相B為acetonitrile。 圖三. 開放系統下，基質比例對甘油酯化程度之影響。甘油分別為5 mmole、3.75 mmole、3 mmole、2.5 mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，常壓，反應溫度為65 ℃。轉化率以甘油酯化程度來計算。XG為甘油之醇基被酯化率。 6. 參考文獻 [1]Anna, M. F., Patrick, A., Bo, M., 1996. Glyceride synthesis in a solvent-free system. Jaocs. 73, 1489-1495. [2]Kim, S. M., Rhee J. S., 1991. Production of medium-chain glycerides by immobilized lipase in a solvent-free system. Jaocs. 68, 499-503. [3]Selmi, B., Ergan, F., Barbotin, J. N., Thomas, D., 1997. Lipase-catalyzed synthesis of tricaprylin in a medium solely composed of substrates. Water production and elimination. Enzyme Microb. Technol. 20, 322-325. [4]Brusilow, S W., 2000. Triglycerides and ethyl esters of phenylalkanoic acid and phenylalkenoic acid useful in the treatment of various disorders. US6083984. 4. 結果與討論 4.1 酵素篩選 結果如圖一所示，在相同條件下只有Novo 435 lipase可合成出最高含量之三苯基丁酸甘油酯，其餘的脂解酵素都僅能合成出單苯基丁酸甘油酯與雙苯基丁酸甘油酯，及極少量之三苯基丁酸甘油酯，因此在日後酵素的選擇上，將選用Novo 435 lipase來當做酯化反應之催化劑。 4.2 反應系統之篩選 結果如表一所示，在有機溶劑系統下，經168小時反應時間，苯丁酸有60 ％以上會轉化成單苯基丁酸甘油酯，只有少量轉化成雙苯基丁酸甘油酯，其中僅有二氯甲烷(dichloromethane)能合成出三苯基丁酸甘油酯，但轉化率只有1.91 ％，若在無溶劑系統下，三苯基丁酸甘油酯轉化率可達4.19 ％。因此將選擇無溶劑系統作為本實驗之適當反應系統，除可解決極性甘油在非極性溶劑溶解度偏低的限制，且能有利於後段產物分離純化，且無毒性溶劑使用之問題。 圖四. 真空系統下，真空度對三苯基丁酸甘油酯轉化率之影響。甘油5 mmole，苯基丁酸15 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，反應溫度為65 ℃，真空度分別為760 torr、380 torr、150 torr、50 torr、1 torr。 表一. 密閉系統下有機溶劑與無溶劑系統之篩選，有機溶劑下甘油1 mM，苯基丁酸3 mM；無溶劑系統下甘油1 mmole，苯基丁酸3 mmole，Novo 435 lipase 0.3 g，反應溫度45 ℃，反應時間168小時。Xmono、 Xdi、 Xtri 、XT分別為單苯基丁酸甘油酯、雙苯基丁酸甘油酯、三苯基丁酸甘油酯與總苯基丁酸甘油酯之轉化率。*：free表示無溶劑系統。